宋 囡， 何文智， 王智民， 任艷玲△

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2藥學(xué)院，3第一臨床學(xué)院，遼寧沈陽110032)

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種多潛能細胞，可分化為多種細胞，通過誘導(dǎo)其分化為成骨細胞后，促進骨形成，是骨組織工程中的重要部分［1］。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認為，腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，而BMSCs主要來自于骨髓中，與中醫(yī)學(xué)“腎主骨”理論有相似之處［2-3］。左、右歸丸為中醫(yī)補腎經(jīng)典方劑，分別具有滋補腎陰和溫補腎陽之功，雖然既往有左、右歸丸均能促進BMSCs成骨分化的研究［4-5］，但未見到兩方對BMSCs成骨誘導(dǎo)的比較研究。本文旨在通過觀察左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs成骨分化的影響，探討以“滋補腎陰”和“溫補腎陽”立法的方藥對BMSCs成骨分化的影響機制。

材料和方法

1 動物

SPF級SD大鼠70只，2月齡，體重(210±10)g，雌雄各半，購買于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK(遼)2010－0001，用于制備含藥血清。提取和培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞采用上述同種雄性大鼠2只。

2 藥物

中藥飲片購買于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，左歸丸(成分:熟地黃24 g、炒山藥12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿角膠12g、菟絲子12 g、牛膝9 g、龜板膠12 g)、右歸丸(成分:熟地黃24 g、炒山藥12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g、當(dāng)歸 9 g、肉桂 6 g、杜仲 9 g、附子 6 g)、共同藥方(成分:熟地黃24 g、炒山藥 12 g、枸杞子12 g、山茱萸12 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g)、滋陰藥方(熟地黃24 g、炒山藥 12 g、枸杞子 12 g、山茱萸 12 g、龜板膠12 g)和補陽藥方(肉桂6 g、杜仲9 g、附子6 g、鹿角膠12 g、菟絲子12 g)，以上5種藥方自制成水煎劑，生藥量為1 g·mL－1;戊酸雌二醇片(補佳樂;Delpharm Lille S．A．S，國藥準(zhǔn)字 J20080036)。

3 試劑與儀器

改良型α-MEM培養(yǎng)液和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(HyClone);胰酶(Sigma);CD29抗體、CD45抗體、CD11b/c抗體和CD90抗體(Biolegend);Anti-CollagenⅠ抗體(博奧森);Anti-GAPDH抗體(中杉金橋);Anti-Cbfα1/Runx2抗體(Abcam);realtime RT-PCR試劑盒(TaKaRa);引物委托TaKaRa公司設(shè)計合成，Cbfα1上游引物5'-ATGACGGTAACCACAGTCCCATC-3'，下游引物 5'-ATGACGGTAACCACAGTCCCATC-3'，擴增長度為86 bp;ColⅠ上游引物5'-AGCAGACGGGAGTTTCACCTC-3'，下 游 引 物 5'-TGTCTTCTTGGCCATGCGTCA-3'，擴 增長度為 193 bp;GAPDH上游引物5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，下游引物 5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'，擴增長度為150 bp。3111二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo)，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀(BD)，BioSpec-nano型紫外可見分光光度計(島津)，Mx3000P型Real-Time PCR儀(Agilent)。

4 主要方法

4．1 含藥血清制備與實驗分組 將70只大鼠隨機分為7組:左歸丸組(ZGW)、右歸丸組(YGW)、共同藥組(GTY)、滋陰藥組(ZYY)、補陽藥組(BYY)、補佳樂組(BJL)和空白對照組，每組10只，雌雄各半。按每kg體重大鼠的給藥量為人的6．3倍計算，并且每天給大鼠灌胃量為正常人用藥量的2倍，每天早晚各灌胃1次，空白對照組灌服蒸餾水。于第4天給藥2 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，采用大鼠腹主動脈取血，靜置2 h 后，2 500 r·min－1、4 ℃離心20 min，收集血清，56℃水浴滅活30 min，分裝后，－86℃保存。實驗分為8組:ZGW+YDJ組、YGW+YDJ組、GTY+YDJ組、ZYY+YDJ組、BYY+YDJ組、BJL+YDJ組、YDJ組和 control組，見表1。

表1 實驗分組Table 1．Experimental groupsing

4．2 BMSCs分離培養(yǎng) 將2月齡大鼠脫頸處死后，75%乙醇浸泡15 min后，移入超凈臺，在無菌條件下取下雙側(cè)股骨和脛骨，剪掉骨的兩端，暴露骨髓腔后，用5 mL含青、鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓腔至平皿中，直至骨的顏色變白，收集平皿中液體到離心管中，1 000 r·min－1離心 3 min，倒掉上清液，用含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液重懸細胞后，轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶，再移到CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，傳至第4代細胞，用于以下實驗。

4．3 BMSCs鑒定 第4代細胞經(jīng)PBS洗3遍，胰酶消化，再用1 mL PBS重懸后轉(zhuǎn)入1．5 mL EP管中，1 500 r·min－1離心 5 min，1 mL PBS 重懸，細胞濃度為1×109cells·L－1，分別加入 CD29抗體、CD45 抗體、CD11b/c抗體和 CD90抗體，避光，4℃孵育30 min，再用PBS清洗1次，0．3 mL PBS再次重懸，上流式細胞儀檢測。

4．4 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色采用改良鈣鈷法，P4細胞經(jīng)胰酶消化后，以5×107cells·L－1接種于 24 孔培養(yǎng)板(1 mL/well)，4 d(根據(jù)前期繪制生長曲線的情況)后饑餓培養(yǎng)，24 h后棄饑餓液，分別加入8種干預(yù)液1 mL，每組3復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)9 d后，棄原培養(yǎng)液，95%乙醇固定15 min，干燥后;加入ALP孵育液，于37℃孵育4 h;流水洗10 min;2%硝酸鈷作用5 min;蒸餾水洗片刻;1%硫化銨水溶液(現(xiàn)配用)處理1 min;蒸餾水沖洗。顯微鏡觀察。

4．5 礦化結(jié)節(jié)觀察 采用茜素紅染色法，接種細胞同方法4．4項，培養(yǎng)14 d(每3d換液1次)后棄孔中的培養(yǎng)液，PBS洗2次，95%乙醇固定10 min;PBS洗3次;0．1%茜素紅-Tris-HCl 37℃孵育30 min;自來水沖洗，室溫干燥。顯微鏡觀察。

4．6 核心結(jié)合因子α1(core binding factor alpha 1，Cbfα1)和Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ，ColⅠ)mRNA檢測 采用RT-PCR法，第4代BMSCs接種于8個25 cm2培養(yǎng)瓶，4 d后饑餓，24 h后加各組培養(yǎng)液6 mL，9 d(每3 d換液1次)后將細胞用 PBS洗3遍后，每瓶中加入500μL RNAiso Plus，刮取細胞，吸入預(yù)冷的1．5 mL EP中，用RNAiso Plus試劑盒提取細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA純度A260/A280在1．8～2．2之間。去除基因組DNA，反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)和染料法(SYBR Green I)相對定量分析，反轉(zhuǎn)錄按如下條件反應(yīng):37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。實時定量PCR儀中按如下條件反應(yīng):95℃ 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

4．7 Cbfα1和ColⅠ蛋白檢測 采用 Western blotting法，細胞接種及含藥血清干預(yù)同方法4．6項，9 d后，棄培養(yǎng)液，4℃預(yù)冷的PBS洗3遍，甩干;每瓶細胞加入裂解液100μL，細胞刮至瓶底一角，冰上靜置30 min;收集至預(yù)冷的離心管中，12 000 r·min－1、4℃ 離心10 min，取上清;BCA試劑盒測定蛋白濃度，蛋白變性后，每孔上樣20μL，電泳后轉(zhuǎn)膜3 h，Ⅰ抗孵育1 h后，4℃過夜，次日Ⅱ抗孵育1 h后，暗室中加入ECL發(fā)光液，曝光30 min，掃描圖像并分析結(jié)果，計算目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH條帶的吸光度比值，再各組比較。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13．0軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較用One-way ANOVA，方差齊采用LSD檢驗，方差不齊采用 Tamhane's方法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BMSCs形態(tài)學(xué)觀察

細胞接種于培養(yǎng)瓶后，24 h后可見部分細胞貼壁，呈圓形較多，透亮，3 d后可見大部分細胞已貼壁，有突觸伸出，細胞多呈菱形或多角形，可進行首次換液，10～12 d細胞達80%融合，可進行首次傳代，第4代細胞多呈紡錘形生長，排列為漩渦狀，見圖1。

Figure 1．Morphology of BMSCs(×100)．A:P0 BMSCs at 10 d;B:P4 BMSCs at 5 d．圖1 BMSCs的形態(tài)

2 BMSCs的流式細胞術(shù)鑒定

經(jīng)流式細胞術(shù)檢測，CD90(70．61%)和 CD29(98．38%)表達為陽性，CD11b/c(11．23%)和 CD45(7．64%)表達為陰性，見圖2。

3 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs ALP活性的影響

與control組比較，其它組ALP活性均增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與YDJ組比較，ZGW+YDJ和ZYY+YDJ組ALP活性增強，BYY+YDJ和BJL+YDJ組ALP活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與 ZGW+YDJ組比較，YGW+YDJ、GTY+YDJ、BYY+YDJ和 BJL+YDJ組 ALP活性降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖3。

Figure 2．Identification of BMSCs by flow cytometry．A:PerCP/Cy5．5 anti-CD90;B:APCanti-CD29;C:PE anti-CD11b/c;D:PE anti-CD45．圖2 BMSCs的流式細胞術(shù)鑒定

Figure 3．The ALP activity in BMSCs induced by sera containing Zuogui pill，Yougui Pill and their disassembled prescriptions(×100)．A:ZGW+YDJ;B:YGW+YDJ;C:GTY+YDJ;D:ZZY+YDJ;E:BYY+YDJ;F:BJL+YDJ;G:YDJ;H:control．Mean ±SD．n=3．*P ＜0.05 vs control;▲P ＜0.05 vs YDJ;★P ＜0.05 vs ZGW+YDJ．圖3 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs ALP活性的影響

4 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs礦化結(jié)節(jié)的影響

與control組比較，其它組礦化結(jié)節(jié)均有增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與YDJ組比較，ZGW+YDJ和ZYY+YDJ組礦化結(jié)節(jié)均有增加，BYY+Y DJ和BJL+YDJ組礦化結(jié)節(jié)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與 ZGW+YDJ組比較，YGW+YDJ、GTY+YDJ、BYY+YDJ和 BJL+YDJ組礦化結(jié)節(jié)均有減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。

5 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs Cbfα1 mRNA表達的影響

與control組比較，其它組Cbfα1 mRNA表達均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與YDJ組比較，ZGW+YDJ、YGW+YDJ、GTY+YDJ 和 ZYY+YDJ組Cbfα1 mRNA表達均上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與ZGW+YDJ組比較，YGW+YDJ、GTY+YDJ、BYY+YDJ和 BJL+YDJ組 Cbfα1 mRNA表達均下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖5。

Figure 5．Cbfα1 mRNA expression in BMSCs induced by sera containing Zuogui pill，Yougui pill and their disassembled prescriptions．A:ZGW+YDJ;B:YGW+YDJ;C:GTY+YDJ;D:ZZY+YDJ;E:BYY+YDJ;F:BJL+YDJ;G:YDJ;H:control．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs control;▲P ＜0.05 vs YDJ;★P ＜0.05 vs ZGW+YDJ．圖5 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs Cbfα1 mRNA表達的影響

6 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs ColⅠmRNA表達的影響

與control組比較，除BYY+YDJ組外，其它組均能上調(diào)ColⅠmRNA表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與YDJ組比較，ZGW+YDJ和ZYY+YDJ組能上調(diào)ColⅠmRNA表達，BBY+YDJ和 BJL+YDJ組下調(diào)ColⅠmRNA表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與 ZGW+YDJ組比較，YGW+YDJ、GTY+YDJ、BYY+YDJ和 BJL+YDJ組下調(diào) ColⅠmRNA 表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖6。

7 左、右歸丸及其拆方含藥血清對 BMSCs的Cbfα1蛋白表達的影響

與control組比較，除 BYY+YDJ組外，其它組Cbfα1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與YDJ組比較，ZGW+YDJ和 ZYY+YDJ組Cbfα1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與 ZGW+YDJ組比較，YGW+YDJ、GTY+YDJ、BYY+YDJ和 BJL+YDJ組 Cbfα1 蛋白表達降低，而ZYY+YDJ組Cbfα1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖7。

Figure 6．ColⅠmRNA expression in BMSCs induced by sera containing Zuogui pill，Yougui pill and their disassembled prescriptions．A:ZGW+YDJ;B:YGW+YDJ;C:GTY+YDJ;D:ZZY+YDJ;E:BYY+YDJ;F:BJL+YDJ;G:YDJ;H:control．Mean ±SD．n=3．*P ＜0.05 vs control;▲P ＜0.05 vs YDJ;★P ＜0.05 vs ZGW+YDJ．圖6 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs ColⅠmRNA表達的影響

Figure 7．Cbfα1 protein expression in BMSCs induced by sera containing Zuogui pill，Yougui pill and their disassembled prescriptions．A:ZGW+YDJ;B:YGW+YDJ;C:GTY+YDJ;D:ZZY+YDJ;E:BYY+YDJ;F:BJL+YDJ;G:YDJ;H:control．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs control;▲P ＜0.05 vs YDJ;★P ＜0.05 vs ZGW+YDJ．圖7 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs Cbfα1蛋白表達的影響

8 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs ColⅠ蛋白表達的影響

與control組比較，除 BYY+YDJ組外，其它組Col 1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與YDJ組比較，ZGW+YDJ和ZYY+YDJ組Col 1蛋白表達升高，BYY+YDJ組ColⅠ蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與ZGW+YDJ組比較，GTY+YDJ、BYY+YDJ和 BJL+YDJ組 ColⅠ蛋白表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖8。

Figure 8．ColⅠprotein expression in BMSCs induced by sera containing Zuogui pill，Yougui pill and their disassembled prescriptions．A:ZGW+YDJ;B:YGW+YDJ;C:GTY+YDJ;D:ZZY+YDJ;E:BYY+YDJ;F:BJL+YDJ;G:YDJ;H:control．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs control;▲P ＜0.05 vs YDJ;★P ＜0.05 vs ZGW+YDJ．圖8 左、右歸丸及其拆方含藥血清對BMSCs ColⅠ 蛋白表達的影響

討 論

中醫(yī)理論認為，“腎生骨髓”，“腎充則髓實”(《素問·陰陽應(yīng)象大論》)。腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，這是“腎主骨”的理論基礎(chǔ)［6］。精是構(gòu)成人體生命活動的有形精微物質(zhì)，是構(gòu)成人體和維持人體生命活動的最基本物質(zhì)。BMSCs是一種多潛能細胞，主要存在于骨髓中，在個體發(fā)育成熟過程的特定狀態(tài)下及組織修復(fù)過程中起著重要的作用，其功能不足則會導(dǎo)致生長發(fā)育障礙。目前研究認為腎精與BMSCs存在一定的相關(guān)性［7］，BMSCs對骨的生長發(fā)育及功能的維持起著非常重要的作用。左、右歸丸是中醫(yī)補腎益精法經(jīng)典代表方，均出自《景岳全書·新方八陣》。左歸丸用于肝腎精血虛損，從《內(nèi)經(jīng)》“精不足者，補之以味”而立法，《素問·陰陽應(yīng)象大論》云:“形不足者，溫之以氣;精不足者，補之以味?！狈街惺斓攸S、山藥、山茱萸補肝腎益陰血，龜板膠、鹿角膠合用可峻補精血，調(diào)和陰陽，再加菟絲子、枸杞子平補肝腎，牛膝以壯腰膝;右歸丸治命門火衰，真陽虛弱，在附子、肉桂、鹿角膠、菟絲子、杜仲等溫補腎陽之中，又用大量的熟地黃配合山藥、山茱萸、枸杞子滋陰補腎，填精補髓，于陰中求陽，滋陰生氣。同時，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)左、右歸丸可以作為“補腎”的代表方促進BMSCs的成骨分化。但由于2方補腎填精的機制不同，所以2方在促進BMSCs成骨分化方面是否有不同之處值得探討。補佳樂戊酸雌二醇片是臨床常用的一種雌激素，可以抑制骨的吸收以促進骨的形成［8］，而現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)左、右歸丸也可以通過發(fā)揮其類雌激素樣的作用促進骨形成［9-10］，故本實驗選用補佳樂為陽性對照藥，與左、右歸丸及其拆方分別誘導(dǎo)BMSCs成骨分化。

本實驗首先對體外分離培養(yǎng)的BMSCs進行鑒定，BMSCs因其有貼壁性的特點，傳至第4代后細胞純化，表達多種細胞的表面標(biāo)志［11-13］，如 CD29、CD90、CD71、CD44、CD105、CD106 等，以上均是 BMSCs的重要表面標(biāo)志物，同時又由于它屬于非造血類細胞，不表達 CD34、CD45、CD11b、CD14 等表面抗原，經(jīng)流式細胞術(shù)檢測CD29和CD90表達陽性，CD11b/c和CD45表達陰性，故 BMSCs得以鑒定。目前對于BMSCs的成骨分化研究很多，這一過程受諸多因素的影響［14-15］，如ALP是成骨細胞所分泌的一種酶蛋白，ALP活性的高表達是成骨細胞分化的標(biāo)志，礦化結(jié)節(jié)的形成也是成骨的另一標(biāo)志［16-17］，Cbfα1是間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它的表達是成骨細胞開始分化的標(biāo)志［18-19］。ColⅠ是礦化骨中唯一的膠原類型，代表成骨過程中有機基質(zhì)的形成［20-21］。實驗結(jié)果表明左歸丸組和滋腎陰藥組均可協(xié)同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，顯著促進 ALP生成，礦化結(jié)節(jié)的形成，上調(diào)Cbfα1 和 ColⅠmRNA，促進 Cbfα1 和 ColⅠ蛋白的高表達，且優(yōu)于誘導(dǎo)劑組，而左歸丸組和滋腎陰藥組之間無顯著差異;同時，我們發(fā)現(xiàn)右歸丸組、2方共同藥組、補腎陽藥組和補佳樂組對于以上的成骨指標(biāo)的檢測均不如左歸丸組。由此可見，左歸丸組和滋腎陰藥組協(xié)同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)BMSCs成骨分化為佳，進一步說明了其對BMSCs成骨分化的協(xié)同作用，以“滋補腎陰”立法的左歸丸組和滋腎陰藥組優(yōu)于以“溫補腎陽”立法的右歸丸組和補腎陽藥組，但二者對于BMSCs成骨分化過程中是否作用于不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有待進一步研究。