陳 蕊， 劉培晶， 嚴金川△， 顧雨春

(1江蘇大學附屬醫(yī)院心內科，江蘇鎮(zhèn)江212001;2北京大學分子醫(yī)學研究所，北京100871)

肺動脈高壓是一種以肺循環(huán)阻力和肺動脈壓進行性增加為特征的疾病，其發(fā)病率、致殘率和病死率都很高。K+通道在調節(jié)肺血管張力、肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)靜息膜電位、增殖凋亡及肺血管重構時發(fā)揮重要作用。PASMCs上主要存在5類鉀離子通道，包括鈣激活性鉀離子通道(calcium-activated potassium channel，KCa)、電壓門控型鉀離子通道 (voltage-dependent potassium channel，KV)、內向整流性鉀離子通道(inward rectifier potassium channel，KIR)、ATP 敏感性鉀離子通道(ATP-sensitive potassium channel，KATP)和雙孔鉀通道(two-pore-domain potassium channel，K2P)［1］。大電導鈣激活性鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium channel，BKCa)是 KCa的一種亞型，廣泛分布于各類動脈平滑肌細胞上，對血管舒張起重要調節(jié)作用。

ω-3多不飽和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid，ω-3 PUFA)能通過減少缺氧性肺動脈高壓模型中肺血管肌化、抑制肺纖維化等途徑實現(xiàn)抗肺動脈高壓的作用［2］。ω-3 PUFA主要包括二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)。目前研究發(fā)現(xiàn)，DHA對心肌細胞及冠狀動脈平滑肌細胞上多類離子通道有作用，但其對PASMCs上離子通道的影響尚不明確。本研究采用膜片鉗技術觀察DHA對Sprague-Dawley大鼠PASMCs上BKCa的影響，探討DHA抗肺動脈高壓的離子機制。

材料和方法

1 動物和器材

清潔級Sprague-Dawley大鼠，體質量(180±30)g，雌雄不拘，由江蘇大學動物中心提供。Multiclamp 700B膜片鉗放大器(Axon)，DigiData 1322型數/模(或模/數)轉換器(Axon)，pClamp 10．2 脈沖發(fā)放和數據采集軟件(Axon)。C1SI激光掃描共聚焦顯微鏡(Nikon)。

2 試劑及溶液

DHA(Sigma)使用前以無水乙醇配制成10 mmol/L的母液，分裝避光保存于－20℃?zhèn)溆?。使用時無水乙醇的終濃度＜0．4%，以防止無水乙醇對離子通道的影響。分離血管用生理鹽溶液(PSS)成份(mmol/L):NaCl 130，KCl 5，MgCl21．2，CaCl21．5，HEPES 10，葡萄糖10。分離細胞用無鈣PSS液，將分離血管用的PSS液中的CaCl2用等摩爾MgCl2代替。2種PSS液用NaOH調節(jié)pH至7．4。分離平滑肌細胞酶液(g/L):木瓜蛋白酶4，膠原酶Ⅰ型2，牛血清白蛋白1，二硫蘇糖醇0．5，溶于無鈣PSS液中。記錄BKCa電流的細胞外液 (mmol/L):NaCl 145，KCl 4．0，CaCl21．0，MgCl21．0，HEPES 10，葡萄糖 10，用NaOH調pH至7．4。記錄 BKCa電流的電極內液(mmol/L):KCl 125，Na2ATP 5，Na2GTP 0.5，MgCl24，HEPES10，EGTA 0．1，用 KOH 調節(jié) pH 值至7．4。同時細胞外液加KV通道特異性抑制劑4-氨基吡啶(5 mmol/L)。急性缺氧溶液:2 mmol/L連二亞硫酸鈉細胞灌流液，此時氧分壓在60 min內為0 mmHg，pH 值不發(fā)生改變［3］。

3 DHA對BK Ca電流的作用

大鼠單個PASMC的分離采用傳統(tǒng)的酶解方法［4］。取酶解獲得的細胞懸液于預處理有L-多聚賴氨酸的玻片中，將玻片粘于灌流槽，待細胞充分貼壁，平放在倒置顯微鏡上，取狀態(tài)良好的細胞進行膜片鉗實驗。記錄電極用玻璃毛細管，經電極拉制儀拉制成微電極，阻抗為3～6 MΩ。用全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗下記錄BKCa電流。記錄電流時，鉗制電壓為－70 mV，指令電壓從－60 mV至+60 mV，階躍電壓為10 mV，脈沖時間為400 ms的去極化刺激13次，頻率為0．2 Hz，信號采集頻率為10 kHz，濾波頻率為2 kHz。采樣后數據由Clampfit 10．2軟件自動記錄，存儲于計算機硬盤內，供測量分析。所有實驗均在室溫(25±1)℃下進行。通道電流密度(pA/pF)為電流強度與細胞膜電容的比值，以消除不同細胞表面積的電流誤差，膜電容可直接在放大器上讀出。觀察0、0．01、0．1、1 和10 μmol/L DHA對BKCa電流的影響。

4 急性缺氧及急性缺氧+DHA對BK Ca電流的作用

同樣方法記錄 BKCa電流，以含有終濃度為2 mmol/L連二亞硫酸鈉的細胞灌流液灌流，觀察急性缺氧對BKCa電流的影響。以含有10μmol/L DHA的急性缺氧溶液灌流，觀察急性缺氧時DHA對BKCa電流的作用。

5 DHA對PASMCs胞內游離鈣離子濃度(［Ca2+］i)的影響

酶解法獲得 PASMCs后，加入含 Fluo-8/AM(5 μmol/L)的D-Hanks液，置37℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，棄孵育液，D-Hanks液清洗3次，將載有細胞的玻片移入激光共聚焦顯微鏡載物臺的灌流槽，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm。細胞內熒光強度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)的變化可指示［Ca2+］i的相對變化。激光共聚焦顯微鏡下連續(xù)動態(tài)掃描，每視野觀察3～4個細胞，每秒取一幀圖像，共400 s，應用連續(xù)激光掃描曲線觀察細胞內［Ca2+］i的變化。

6 統(tǒng)計學處理

計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示。用SPSS 17．0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，自身對照采用配對t檢驗或單因素方差分析，組間資料采用非配對t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。數據處理使用OriginPro 7．5科技繪圖及數據分析軟件。

結 果

1 DHA對大鼠PASMCs BK Ca的影響

DHA濃度為0．01μmol/L時，BKCa的電流強度有所增加，但與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義;0.1、1和10μmol/L DHA對BKCa電流強度呈濃度依賴性增加(圖 1A)，I-V曲線上移(圖 1B)(P＜0.01)，且該激活電流能被BKCa特異性抑制劑伊比利亞蝎毒素(iberiotoxin，IBTX)所抑制(圖1C)。在指令電壓為+60 mV時，不同濃度的 DHA(0．1、1和10μmol/L)使 BKCa電流密度分別增加(47．4±6.9)%、(323．0 ±13.1)%和(460．2 ±45．6)%。

2 急性缺氧及DHA對BK Ca的作用

急性缺氧能抑制 BKCa(圖2A)，I-V曲線下移(圖2B)。指令電壓為+60 mV時，BKCa電流密度從(32．7 ±8．5)pA/pF 降低至(11．9 ±5．8)pA/pF(P＜0．01)。DHA(10μmol/L)能逆轉急性缺氧對BKCa的抑制作用(P ＜0．01)，見圖3。

3 DHA 對 PASMCs［Ca2+］i的影響

未灌流DHA前，細胞熒光強度均勻;灌流DHA 50 s后，即刻發(fā)生熒光面積縮小，強度增加，在150 s達峰值，［Ca2+］i最大增加率為(71．9 ±4．1)%(P ＜0．01)，之后逐漸降低，見圖 4。

Figure 1．DHA increased whole-cell BKCa currents in rat PASMCs．A:representative tracings showed BKCa currents at different DHA concentrations(0，0．01，0．1，1 and 10 μmol/L)．B:I-V relationships of BKCa currents at different DHA concentrations．Mean± SD．n=5．＊＊P ＜ 0．01 vs control．C:representative tracings showed that the DHA-activated K+currents were inhibited by iberiotoxin(IBTX)．圖1 不同濃度DHA對大鼠PASMCs BK Ca電流的影響

討 論

肺動脈高壓的發(fā)生機制復雜，目前尚未完全清楚，其病因包括肺血管床減少及低氧導致的肺血管收縮。低氧造成的PASMCs鉀離子流減少，鉀通道活性降低及其基因表達減少在肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用［5］。BKCa分布廣泛，其開放具有Ca2+敏感性和電壓依賴性。持續(xù)激活BKCa會引起膜超極化，降低L型鈣通道活性，發(fā)揮負反饋作用，引起血管平滑肌舒張;反之，抑制BKCa會導致血管收縮［6］。

DHA對心血管的保護作用已廣為人知。DHA能抑制心肌細胞膜上短時外向鉀電流(Ito)和延遲整流鉀電流(IK)，達到抗心律失常作用［7］。DHA經過細胞色素P450表氧化酶代謝產生的環(huán)氧二十碳烯酸，可激活BKCa，使冠狀動脈平滑肌細胞處于超極化狀態(tài)，從而舒張冠狀動脈［8］。因此，DHA通過影響離子通道而產生的心血管保護作用亦已被人們熟知。本研究顯示，DHA對離體 PASMCs細胞膜上BKCa有明顯激活作用;急性缺氧能明顯抑制BKCa，但這種抑制作用被DHA逆轉。研究發(fā)現(xiàn)慢性低氧性肺動脈高壓大鼠PASMCs上的BKCa電流較正常大鼠顯著降低［9］。Dospinescu 等［10］發(fā)現(xiàn)肺靜脈平滑肌細胞膜上BKCa的氧氣敏感性與其α亞基的應激調控外顯子(stress-regulated exon，STREX)結構相關。而PASMCs上BKCa的氧氣敏感性是否也與STREX相關則有待進一步研究。Thuringer等［11］發(fā)現(xiàn)低氧對兔肺動脈主干PASMCs的BKCa無效應。急性缺氧時，肺動脈主干與體循環(huán)動脈相似，主要發(fā)生舒張反應，而阻力性肺動脈主要發(fā)生快速可逆的收縮反應［12］。因此我們認為不同實驗組結果有差異可能與研究的肺動脈段標本不同有關。本研究發(fā)現(xiàn)在D-Hanks液中，DHA 可增加 PASMCs［Ca2+］i，這一效應即刻發(fā)生，在達到峰值后，［Ca2+］i逐漸降低。［Ca2+］i增加主要通過細胞外鈣離子內流和細胞內基質網釋放，后者又被稱為鈣閃爍［13］。鈣閃爍現(xiàn)象可激活BKCa，引起平滑肌細胞的舒張［14］。研究發(fā)現(xiàn)，DHA可通過促進三磷酸肌醇產生，激活蛋白激酶C，使U937細胞系發(fā)生外鈣內流和內鈣釋放，增加細胞內［Ca2+］i，進而誘導其凋亡［15］。DHA 亦可以通過這 2條途徑增加T細胞內［Ca2+］i通道［16］。因此我們認為DHA誘導PASMCs的內鈣釋放，激活BKCa，K+外流增加導致細胞膜電位超極化，電壓依賴性鈣離子通道關閉，細胞內游離鈣離子減少，引起血管舒張，從而抵抗低氧誘發(fā)的肺血管收縮，發(fā)揮其抗肺動脈高壓作用。

Figure 2．Inhibition of BKCa currents by hypoxia in rat PASMCs．A:representative tracings showed BKCa currents elicited by step depolarization(－60 to+60 mV in 10 mV increments)from a holding potential of－70 mV under normoxia and hypoxia．B:I-V relationships of BKCa currents under normoxia and hypoxia．Mean ±SD．n=5．＊＊P ＜0．01 vs normoxia．圖2 急性缺氧對BK Ca電流的影響

Figure 3．DHA increased whole-cell BKCa currents in rat PASMCs in hypoxia．A:representative tracings of BKCa currents under normoxia and hypoxia after preincubation with 10 μmol/L DHA．B:I-V relationships of BKCa currents under normoxia and hypoxia after pre-incubation with 10 μmol/L DHA．Mean±SD．n=5．＊＊P ＜0．01 vs normoxia．圖3 DHA預處理后，急性缺氧對BK Ca電流的影響

Figure 4．DHA increased［Ca2+］i in rat PASMCs．Mean±SD．n=17．＊＊P ＜0．01 vs control at 150 s．圖4 DHA對大鼠PASMCs［Ca2+］i的影響

肺動脈高壓可致肺血管重構，PASMCs增殖增加，凋亡減少，增殖和凋亡之間平衡失調，中膜肥厚。鉀通道的功能和表達與PASMCs增殖和凋亡密切相關。各種原因誘導的凋亡均存在較強的K+外流，使胞漿內K+濃度降低。DHA是否通過調節(jié)PASMCs上鉀離子通道而抑制PASMCs的過度增殖尚需進一步研究。