華 平， 劉家良， 楊淞然， 江慧琦， 王 萌， 陶 俊， 楊艷旗

(1中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院心胸外科，廣東廣州510120;2廣州市第一人民醫(yī)院腦內科，廣東廣州510180)

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潛能，能分泌多種生物活性因子，且來源豐富，免疫原性低，是治療心肌梗死的理想種子細胞，可阻止心室重構，改善心功能［1-2］，在心肌梗死的的細胞治療和基因治療中有著巨大的應用價值。但移植后缺血缺氧的局部微環(huán)境導致MSCs增殖和存活能力受限［3］，從而限制了干細胞移植的治療效果。因此，促進細胞在非理想環(huán)境下的增殖能力，尤其是抗凋亡能力成為目前的研究熱點。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)是細胞凋亡過程中的關鍵執(zhí)行者［4］。本實驗采用前期研究中篩選出來的針對caspase-3干擾效果最好的靶點序列構建shRNA表達載體［5］，通過慢病毒介導的方法轉染MSCs，觀察沉默caspase-3后MSCs的增殖能力、細胞周期變化和抗凋亡能力。

材料和方法

1 材料

SPF級3周齡Sprague-Dawley大鼠由中山大學北校區(qū)動物中心提供。胎牛血清和DMEM/F12培養(yǎng)基(HyClone)，小鼠抗大鼠CD29流式抗體(BD)，小鼠抗大鼠CD45和CD90流式抗體(eBioscience)，慢病毒載體GV115(上海吉凱基因)，MTS試劑盒(Promega)，細胞周期檢測試劑盒(南京凱基)，SYBR Green PCR Master Mix(Toyobo)，Trizol(Invitrogen)，兔抗大鼠 caspase-3單克隆抗體(Anbo)，Hoechst 33258(碧云天生物技術研究所)

2 方法

2．1 MSCs的培養(yǎng)與鑒定 頸椎脫臼法處死SD大鼠，75%乙醇浸濕5 min。超凈臺上取雙側股骨、脛骨，去除骨骺，注射器吸取培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔。收集沖洗液制成單細胞懸液，離心(1 500 r/min，10 min)，棄上清，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，吹打細胞，計數(shù)，以1×1010/L的密度接種，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種48 h后首次換液，以后每3 d換液，直至細胞長滿80% ～90%，0．25%胰酶消化并按1∶3傳代。經多次換液傳代純化MSCs。流式細胞術檢測P2代CD29、CD45和CD90的表達以鑒定MSCs。

2．2 構建慢病毒載體與細胞感染 根據(jù)前期實驗結果，選取針對caspase-3干擾效果最好的靶點序列:5'-GCCGACTTCCTGTATGCTTAC-3'，合成表達 shRNA的2條互補DNA單鏈:5'-CCGGGCCGACTTCCTGTATGCTTACCTCGAGGTAAGCATACAGGAAGTCGGC-TTTTTG-3'，5'-AATTCAAAAAGCCGACTTCCTGTATGCTTACCTCGAGGTAAGCATACAGGAAGTCGGC-3'。上述單鏈退火形成雙鏈，連接到線性化載體GV115后轉化DH5α感受態(tài)細胞，提取質粒進行酶切鑒定并測序。再用293T細胞包裝病毒。取良好生長狀態(tài)的MSCs以(3～5)×106/L的密度接種，細胞融合率為30%～50%時進行病毒感染。同時制備空載體作為對照，并將實驗分為空白對照組、空載體組和轉染組(由廣州萊德爾生物科技有限公司完成)。

2．3 Real-time PCR 檢測 caspase-3、bcl-2和 bax mRNA的表達 收集細胞，Trizol試劑盒抽提總RNA，逆轉錄合成cDNA，取5μL逆轉錄產物進行擴增反應。使用熒光定量PCR儀，采用SYBR Green染料法，以β-actin為內參照。引物設計見表1。反應條件:95℃預熱5 min，95 ℃變性15 s，60℃退火15 s，72 ℃延伸32 s，40個循環(huán)。

表1 引物序列Table 1．Primer sequences

2．4 Western blotting檢測caspase-3蛋白的表達 收集細胞離心(1 000 r/min，5 min)，棄上清，根據(jù)細胞量加入相應的提取緩沖液，收集裂解液，BCA法測定蛋白濃度。配置5%濃縮膠和10%分離膠進行SDS-PAGE電泳。電泳產物轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉溶液封閉，加入兔抗大鼠 I抗(caspase-3 1∶1 000，GAPDH 1∶1 000)，37 ℃孵育2 h，TBST 洗膜5 min×3次，加山羊抗兔 IgG II抗(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次。DAB顯色。用Quantity One軟件對蛋白條帶進行半定量分析。

2．5 MTS檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的細胞配置成1×108/L細胞懸液接種，每孔100μL，放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，收集各個時點的細胞(24 h、48 h、72 h、96 h 和 120 h)加入MTS，比例為1∶10。孵育4 h后，酶標儀讀取 A490數(shù)據(jù)。細胞增殖率=(實驗組A490值－A0)/A0×100%。A0為實驗組第1天的A490值。

2．6 流式細胞術檢測細胞周期 常規(guī)消化細胞，用預冷PBS洗2次，加入預冷70%乙醇，4℃固定過夜。離心收集細胞，以1 mL PBS洗細胞1次，加入500μL PBS含50 mg/L溴化丙啶，100 mg/L RNase A，0．2%Triton X-100，4℃避光孵育30 min。以標準程序用流式細胞儀檢測，計數(shù)(2～3)×104個細胞，結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。

2．7 流式細胞術檢測細胞凋亡率 用PBS溶液輕輕潤洗培養(yǎng)板內細胞，去除PBS溶液;加入0．5 mL不含EDTA的0．25%胰酶，孵育，直至顯微鏡下觀察到細胞開始從培養(yǎng)板壁脫落;輕輕連續(xù)拍打使細胞從培養(yǎng)板壁上完全脫落;將細胞輕輕重懸于預冷的緩沖液中，密度為1×109/L;轉移0．5 mL細胞懸液到干凈的離心管內;加入1．25μL Annexin V-APC，室溫避光反應 15 min;室溫離心(1 000 r/min，5 min)，去除上清;0．5 mL預冷結合緩沖液將細胞重懸;加入10μL溴化丙啶，冰上避光保存，流式細胞儀檢測分析。

2．8 Hoechst染色檢測細胞凋亡 細胞以5×104/L密度接種于用12孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，至細胞爬片。加入1 mL 4%甲醛溶液，4℃固定細胞10 min。去固定液，PBS洗5 min×3次，自然晾干。滴加100μL Hoechst 33258工作液(1 mg/L)，室溫染色10 min。PBS洗5 min×3次。濾紙沾去多余液體，加抗熒光淬滅封片液，封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13．0軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 細胞培養(yǎng)與鑒定

首次換液后見大量貼壁細胞，部分伸出偽足呈短棒狀。3～4 d貼壁細胞增多，細胞集落形成。9～10 d細胞融合成片，沿胞體長軸有序排列，呈旋渦狀。通過傳代逐漸純化MSCs，見圖1。免疫表型鑒定顯示表面標志 CD29和 CD90的陽性率分別為 93．31%和93.45%，造血系統(tǒng)細胞表面標志物CD45的陽性率為5．69%，見圖2，表明獲得的細胞為MSCs。

Figure 1．Morphology of MSCs(×40)．The third-generation MSCs were morphologically consistent，long spindle，arranged in a radial or spiral shape and showed colony growth under phase-contrast microscopy．圖1 MSCs的形態(tài)

Figure 2．Identification of MSCs圖2 MSCs鑒定結果

2 Real-time PCR和Western blotting檢測caspase-3 mRNA和蛋白表達水平

經慢病毒介導方法導入質粒后，轉染組、空載體組和空白對照組mRNA相對表達量分別為0．39±0.06、1．66 ±0．17 和1．91 ±0．31(P ＜0．01)，轉染組的表達量僅為對照組的23．49%和20．31%，干擾效率為76．51%和79．69%，見圖3。通過灰度值分析，轉染組、空載體組和空白對照組的蛋白表達量分別為0．19 ±0．09、0．49 ±0．16 和 0．48 ± 0．14(P ＜0.05)，轉染組的蛋白表達量降低了61%和60%，見圖4，說明caspase-3的表達得到了很好的抑制。

Figure 3．Expression of caspase-3 mRNA．A:MSCs;B:MSCsvector;C:MSCs-shRNA．Mean ± SD．n=3．＊＊ P ＜0.01 vs A or B．圖3 Caspase-3 mRNA的表達

Figure 4．Expression of caspase-3 protein．A:MSCs;B:MSCsvector;C:MSCs-shRNA．Mean ± SD．n=3．*P ＜0.05 vs A or B．圖4 Caspase-3蛋白的表達情況

3 細胞增殖

除第1天外，轉染組的增殖率在各時點均明顯高于對照組(均P＜0．05)，而兩對照組之間無明顯差異(P＞0．05)，見圖5，證實慢病毒系統(tǒng)本身對MSCs的增殖能力無顯著影響，而沉默caspase-3能加快細胞生長。

Figure 5．Proliferative curves of MSCs-shRNA，MSCs-vector and MSCs．Mean ± SD．n=3．*P ＜ 0．05 vs MSCs or MSCs-vector．圖5 細胞增殖曲線

4 細胞周期

與空載體組和空白對照組相比，轉染組S期細胞百分比明顯升高(P＜0．01)，G0/G1期和G1/G2期細胞百分比下降(均P＜0．05)，對照組之前差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，沉默caspase-3后MSCs主要停留在S期，見圖6和表2。

Figure 6．Cell cycle detected by flow cytometry．A:MSCs;B:MSCs-vector;C:MSCs-shRNA．圖6 流式細胞術檢測細胞周期

表2 細胞周期變化Table 2．Changes of cell cycle(%．Mean±SD．n=3)

5 Real-time PCR檢測bcl-2和bax mRNA表達水平

沉默caspase-3后，除caspase-3表達降低外，還觀察到bcl-2表達上調(P＜0．01)，bax表達下調(P＜0．01)，bcl-2/bax比值升高(P ＜0．05)，見圖7。

6 細胞凋亡

流式細胞術檢測各組細胞凋亡率顯示，轉染組的凋亡率低于對照組，見圖8。Hoechst 33258染色后在熒光顯微鏡下觀察到所有細胞的細胞核都呈現(xiàn)藍色熒光，凋亡的細胞核染色質凝聚，細胞核濃縮，見圖9。400倍鏡下，各組細胞選取6個不同的視野進行陽性細胞計數(shù)，得出轉染組的細胞凋亡率為(15．01 ±1．73)%，低于空載體組(25．67% ±3.05%)和空白對照組(23．67% ±1．16%)(P ＜0.05)，兩對照組之間無明顯差異(P＞0．05)。

Figure 7．Expression of bcl-2 and bax mRNA．A:MSCs;B:MSCs-vector;C:MSCs-shRNA．Mean±SD．n=3．*P＜0．05 vs A or B．圖7 bcl-2和bax mRNA的表達

Figure 8．Apoptosis of MSCs detected by flow cytometry assay．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs MSCs or MSCs-vector．圖8 流式細胞術檢測MSCs凋亡

Figure 9．Apoptosis of MSCs detected by Hoechst 33258 staining(×400)．A:MSCs;B:MSCs-vector;C:MSCs-shRNA圖9 Hoechst 33258染色檢測MSCs凋亡

討 論

盡管MSCs移植用于治療心肌梗死具有發(fā)展?jié)摿Γ且浦埠蟮牡痛婊盥适沟弥委熜Ч⒉焕硐?，成為其臨床應用的瓶頸。心肌微環(huán)境是植入的MSCs賴以生存的空間位置和相互關系。微環(huán)境中的細胞外基質和生物活性分子不但對MSCs起著支持、連接、營養(yǎng)和保護等作用，還對其增殖、分化和遷移有著重要的信號調節(jié)作用。細胞外基質與MSCs黏附，通過整合素-FAK-ERK信號通路促進MSCs生長、增殖和遷移［6］。MSCs能旁分泌多種細胞因子，尤其是堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)通過ERK的活化，具有相對較強的促增殖作用［7］。心肌梗死后，局部的缺血缺氧、炎癥反應和再灌注損傷使植入的細胞面臨一個復雜、失穩(wěn)態(tài)和惡劣的微環(huán)境［8］。缺乏基質中的存活信號，細胞毒性因子的產生導致細胞在移植后增殖能力受限，短時間內大量凋亡［9］。同時，心肌的機械刺激也對MSCs的增殖和存活造成一定的影響。

Pouzet等［10］率先提出了“線性關系”理論，認為增加注射細胞的數(shù)量能夠提高移植效率。但隨后的幾項研究結果得出了與此相悖的結論，甚至有報道稱，細胞數(shù)量的增加可導致左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)的惡化［11］。由于用于動物實驗和臨床實驗的移植細胞種類各不相同，而每種細胞的生物學特性都有所差別，加上其它研究因素不盡一致，很難單純分析數(shù)量對療效的影響。

細胞凋亡是由基因控制的程序性死亡，涉及一系列基因的激活、表達以及調控。Caspase家族在凋亡過程中起著關鍵作用。Caspase-3處于凋亡有序級聯(lián)反應的下游，內源性和外源性通路最后都有caspase-3的激活［12］，它的活化是凋亡進入不可逆階段的標志。bcl-2基因家族也與細胞凋亡密切相關。家族成員包括促凋亡基因(bax和bag)和抗凋亡基因(bcl-xL和bcl-2)兩大類。任何因素破壞促凋亡和抗凋亡2組基因或相關蛋白之間的平衡都會導致細胞對外界刺激的敏感性增加，而破壞細胞的結構與功能。bcl-2 mRNA和bax是研究最廣泛的凋亡相關基因，兩者的比值往往決定了細胞的命運［13］。

本實驗針對caspase-3這一凋亡過程中的關鍵執(zhí)行者構建了shRNA表達載體，通過慢病毒介導成功轉染了MSCs，在mRNA和蛋白水平對目的基因的表達起到了有效的干擾，同時觀察到bcl-2 mRNA表達上調，bax mRNA表達下調，bcl-2/bax比值升高。沉默caspase-3后的MSCs增殖率明顯提高，原因可能為細胞周期受到調控，更多的細胞停留在S期和凋亡的細胞數(shù)量減少。凋亡的細胞染色質凝聚，細胞核濃縮，細胞體積縮小，轉染組的凋亡率明顯低于對照組。然而，心肌梗死區(qū)域是一個以缺血缺氧為主要特點的復雜微環(huán)境，下一步需進行體外缺血缺氧模擬或體內細胞移植才能進一步驗證沉默caspase-3能否提高MSCs的抗凋亡能力。