成 瑩， 曾 欣， 許繼德， 岳喜磊， 韓志遠(yuǎn)， 楊春濤

(廣州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，廣東廣州510182)

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞及其組分共同參與，以可逆性氣流阻塞和氣道高反應(yīng)性為特征的慢性炎癥性疾病，氣道重塑是其主要特征之一。哮喘氣道重塑時(shí)氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生諸多改變，其中氣道平滑肌細(xì)胞 (airway smooth muscle cells，ASMCs)肥大和增生是氣道重塑主要的病理改變。有效抑制ASMCs的過度增殖，是治療難治性哮喘的重要途徑。目前參與哮喘氣道平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不清楚。已知Ca2+參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖［1］，而TRPC在調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡中和細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。TRPC基因家族可編碼介導(dǎo)胞外Ca2+內(nèi)流的通道，是構(gòu)成鈣庫操縱性Ca2+通道(store-operated Ca2+channels，SOCs)及受體操縱性Ca2+通道 (receptor-operated Ca2+channels，ROCs)的重要分子基礎(chǔ)。血小板源性生長(zhǎng)因子 (platelet-derived growth factor，PDGF)作為重要的促有絲分裂原可引起ASMCs的增殖，已有研究證實(shí)經(jīng)典瞬時(shí)受體電位通道6(transient receptor potential channel 6，TRPC6)在 PDGF誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌的增殖中發(fā)揮重要作用［2］，但目前尚未明確在其促進(jìn)ASMCs增殖中是否有TRPC的參與。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的大鼠ASMCs為研究對(duì)象，探討TRPC通道是否參與了PDGF誘導(dǎo)的ASMCs增殖，為臨床防治哮喘提供新的靶點(diǎn)。

材料和方法

1 材料

清潔級(jí)雄性SD大鼠(10～12周)購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM/F12培養(yǎng)基購自HyClone;PDGF購自R＆D;CCK-8檢測(cè)試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所;小鼠抗大鼠α-SMAⅠ抗購自Sigma-Aldrich;兔抗大鼠TRPC6Ⅰ抗購自Abcam;β-actin單克隆抗體購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司;FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠的Ⅱ抗和FITC標(biāo)記的山羊抗兔的Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;HRP標(biāo)記羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;TRPC6阻斷劑 SKF96365購自 Sigma-Aldrich;PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒購自日本寶生物工程有限公司;PCR擴(kuò)增引物由大連寶生物公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1．The sequences of the primers

2 方法

2．1 大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 酶消化法聯(lián)合組織貼塊法培養(yǎng)ASMCs并對(duì)ASMCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)及細(xì)胞內(nèi)α-SMA進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，取3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2．2 CCK-8法檢測(cè) PDGF誘導(dǎo)大鼠ASMCs增殖的作用 第3～6代ASMCs接種于96孔培養(yǎng)板中，按照以下方式分組處理:(1)2．5%FBS培養(yǎng)基(無細(xì)胞)空白對(duì)照組;(2)2．5%FBS培養(yǎng)基陰性對(duì)照組;(3)10%FBS培養(yǎng)基陽性對(duì)照組;(4)20μg/L PDGF+2.5%FBS培養(yǎng)基組。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)50%左右時(shí)，換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，以使細(xì)胞同步化于G0期后按上述分組，將各孔細(xì)胞分別換用相應(yīng)的培養(yǎng)基分別繼續(xù)培養(yǎng)6 h、12 h、24 h和48 h后加入CCK-8試劑繼續(xù)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，選擇450 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光度，記為A450。按照以下公式計(jì)算細(xì)胞增殖率:細(xì)胞增殖率(%)=(各孔測(cè)得的A450值－空白孔A450值)/(陰性對(duì)照組 A450值 －空白孔 A450值)×100%。

2．3 細(xì)胞間接免疫熒光法檢測(cè)TRPC6在ASMCs上的表達(dá) 第3代細(xì)胞接種于24孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，4%多聚甲醛溶液固定，室溫下0．3%Triton X-100通透細(xì)胞，5% 牛血清白蛋白37℃封閉30 min后加入稀釋比例為1∶100的兔抗大鼠TRPC6Ⅰ抗100μL，4℃孵育過夜。次日，于37℃復(fù)溫30 min，加入稀釋比例為1∶100的FITC標(biāo)記的山羊抗兔的Ⅱ抗100μL，37℃避光孵育1 h，DAPI溶液室溫孵育5～10 min，在熒光顯微鏡下觀察并拍片。

2．4 Real-time PCR檢測(cè)PDGF誘導(dǎo)ASMCs增殖時(shí)TRPC6 mRNA的表達(dá) 取第4代ASMCs接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)24 h后，換用無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h以使細(xì)胞同步化于G0期，再按照以下方式分組處理:(1)2．5%FBS培養(yǎng)基對(duì)照組;(2)20μg/L PDGF+2．5%FBS培養(yǎng)基組。按Trizol法提取總 RNA，按照 PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒說明書操作，合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件:反應(yīng)條件:37℃ 15 min;85℃ 5 s。然后再按照 SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ (Perfect Real Time)試劑盒說明書在ABI公司7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件:95℃30 s預(yù)變性，95℃ 5 s，60℃ 34 s，重復(fù)循環(huán)40次，熔解曲線分析95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。以βactin 為內(nèi)參照，2－ΔΔCt法計(jì)算各組 TRPC6 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

2．5 Western blotting檢測(cè)TRPC6蛋白的表達(dá) 取第4代ASMCs接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長(zhǎng)24 h后，換用無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h以使細(xì)胞同步化于G0期，再按照以下方式分組處理:(1)2．5%FBS培養(yǎng)基對(duì)照組;(2)20μg/L PDGF+2．5%FBS培養(yǎng)基組。按細(xì)胞裂解液說明書提取細(xì)胞蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，置沸水煮5 min變性蛋白質(zhì);選用5% 濃縮膠，8% 分離膠進(jìn)行電泳，分別用80 V和100 V電壓。然后在300 mA恒流，4℃條件下電轉(zhuǎn)3 h;5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;TBST洗膜3次，每次10 min;分別孵育1∶500兔抗大鼠TRPC6Ⅰ抗及1∶2 000小鼠β-actin單克隆抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min;再室溫分別孵育與其Ⅰ抗相對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG及HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 1 h;TBST洗膜3次，每次10 min;加入ECL反應(yīng)，用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，并用ImageJ軟件對(duì)所得到的條帶進(jìn)行分析。以β-actin為內(nèi)參照，分析各組TRPC6蛋白的相對(duì)含量。

2．6 CCK-8檢測(cè) TRPC6阻斷劑對(duì) PDGF誘導(dǎo)的ASMCs增殖的作用 第3～6代ASMCs接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%左右時(shí)，換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化于G0期，再按照以下方式分組處理:(1)2．5%FBS培養(yǎng)基(無細(xì)胞)空白對(duì)照組;(2)2．5%FBS培養(yǎng)基陰性對(duì)照組;(3)20μg/L PDGF+2．5%FBS培養(yǎng)基組;(4)25μmol/L SKF96365+2．5%FBS培養(yǎng)基組;(5)5 μmol/L SKF96365+20 μg/L PDGF+2．5%FBS培養(yǎng)基組;(6)15μmol/L SKF96365+20μg/L PDGF+2．5%FBS培養(yǎng)基組;(7)25 μmol/L SKF96365+20μg/L PDGF+2．5%FBS培養(yǎng)基組。分別繼續(xù)培養(yǎng)6 h、12 h、24 h和48 h后，每孔加入CCK-8試劑10μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，選擇450 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光度，記為A450。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料間的比較在確定方差齊后采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，各組間的多重比較采用LSD法;如果方差不齊則采用Welch法，組間多重比較采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠ASMCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

在倒置相差顯微鏡下觀察到細(xì)胞多呈梭形，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60%左右時(shí)，可見細(xì)胞胞質(zhì)透明，彼此融合生長(zhǎng)在一起，成束的細(xì)胞平行排列，呈現(xiàn)平滑肌細(xì)胞特征性的“峰－谷”狀生長(zhǎng)，見圖1A。細(xì)胞內(nèi)α-SMA免疫熒光檢測(cè)可見:胞漿內(nèi)可見大量綠色熒光，α-SMA與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行排列，呈網(wǎng)狀或絲狀，見圖1B。采用Image-Pro Plus 6．0軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，得到的細(xì)胞純度在94%左右。

Figure 1．Identification of rat ASMCs．A:morphology of the cells(×100);B:immunofluorescence staining(×200)for α-SMA (green)， with DAPI-stained nuclei(blue)．圖1 大鼠ASMCs的鑒定

2 PDGF誘導(dǎo)大鼠ASMCs增殖

PDGF作用6 h后，PDGF組ASMCs的活力與陰性對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);PDGF作用12 h后，ASMCs的活力與陰性對(duì)照組相比顯著升高(P＜0．05);作用24 h和48 h后，ASMCs的活力與陰性對(duì)照組相比亦顯著升高(P＜0．01)，見圖2。

Figure 2．Proliferation of ASMCs induced by PDGF．Mean ±SEM．n=6．*P ＜ 0．05，＊＊P ＜ 0．01 vs negative control．圖2 PDGF誘導(dǎo)ASMCs增殖

3 TRPC6在大鼠ASMCs上的表達(dá)

用兔抗大鼠TRPC6抗體進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，在熒光顯微鏡下觀察到 TRPC6廣泛表達(dá)于ASMCs，見圖 3。

Figure 3．The expression of TRPC6 in ASMCs(FITC-immunofluorescence staining，×200)．A:DAPI;B:FITC;C:merged．圖3 TRPC6在ASMCs的表達(dá)

4 ASMCs TRPC6 mRNA表達(dá)

PDGF作用12 h后TRPC6 mRNA表達(dá)明顯增加(P ＜0．05)，24 h和48 h升高更明顯(P ＜0．01)，見圖4。

Figure 4．The mRNA expression of TRPC6 in ASMCs．β-actin served as internal reference．Mean ± SEM．n=4．*P ＜0.05，＊＊P ＜0．01 vsβ-actin．圖4 ASMCs TRPC6 mRNA的表達(dá)

5 ASMCs TRPC6蛋白的表達(dá)

PDGF作用6 h和12 h后，TRPC6蛋白表達(dá)較對(duì)照組稍升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);PDGF作用24 h和48 h后，TRPC6蛋白表達(dá)量與相應(yīng)對(duì)照組相比明顯增多(P＜0．05)，見圖5。

Figure 5．The protein expression of TRPC6 in ASMCs．Mean ±SEM．n=4．*P ＜0．05 vs control group．圖5 ASMCs TRPC6蛋白的表達(dá)

6 SKF96365對(duì)PDGF誘導(dǎo)的大鼠ASMCs增殖的作用

所有組在處理6 h和12 h時(shí)ASMCs未出現(xiàn)明顯增殖，各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05);15 μmol/L和25μmol/L SKF96365與PDGF共同作用組在作用24 h和48 h時(shí)才顯著抑制了PDGF誘導(dǎo)的ASMCs增殖(與 PDGF 組相比，P ＜0．01)，而 5 μmol/L SKF96365只在作用48 h時(shí)顯著抑制了ASMCs的增殖(與 PDGF組相比，P＜0．01);25 μmol/L SKF96365單獨(dú)作用于ASMCs時(shí)對(duì)其增殖無明顯作用，見表2。

討 論

支氣管哮喘是一種由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，是嚴(yán)重危害人類健康的常見病。雖然積極正規(guī)的抗炎和平喘治療能夠較好地控制癥狀發(fā)作，卻不能徹底根治哮喘。隨著病程的不斷進(jìn)展，哮喘患者還是會(huì)出現(xiàn)不同程度的氣道重塑，最終發(fā)展為不可逆的氣流阻塞。氣道重塑是指哮喘時(shí)氣道壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生的一系列改變，包括氣道壁增厚、氣道纖維化、平滑肌細(xì)胞增生和肥大、上皮下纖維化及血管分布增多等。氣道重塑幾乎在所有哮喘患者的活檢標(biāo)本中都可被檢測(cè)到，其與哮喘患者的預(yù)后關(guān)系密切。因而，研究氣道重塑的機(jī)制已成為哮喘防治的重點(diǎn)。氣道平滑肌細(xì)胞作為氣道管壁結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成細(xì)胞，是參與氣道重塑的關(guān)鍵性效應(yīng)細(xì)胞。在氣道重塑的過程中，ASMCs的過度增殖不僅會(huì)加重氣道高反應(yīng)性，而且還會(huì)使氣道壁增厚變形，出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的氣道重塑;此外在增殖中，氣道平滑肌細(xì)胞還能由收縮型變成合成型，通過表達(dá)黏附分子，釋放細(xì)胞因子并產(chǎn)生基質(zhì)成分和蛋白酶來促進(jìn)和加重氣道重塑［3-4］。2007 年，Cox 等［5］報(bào)道利用支氣管熱成形術(shù)對(duì)哮喘患者進(jìn)行治療，消減患者的部分支氣管平滑肌，隨訪1年后發(fā)現(xiàn)這些患者的哮喘癥狀得到明顯的控制。這提示我們氣道平滑肌可以作為治療哮喘的重要靶點(diǎn)，有效抑制氣道平滑肌細(xì)胞的增殖可以改善哮喘癥狀，因此，研究哮喘氣道重塑時(shí)ASMCs增殖的機(jī)制具有十分重要的意義。

表2 SKF96365對(duì)PDGF誘導(dǎo)ASMCs增殖的作用Table 2．The influence of SKF96365 on the proliferation of ASMCs induced by PDGF(Mean±SEM．n=12)

Ca2+作為一個(gè)重要的第二信使涉及一系列細(xì)胞功能，例如受精、增殖、生長(zhǎng)、學(xué)習(xí)和記憶、細(xì)胞遷移、收縮和分泌、免疫防御及細(xì)胞凋亡等［6］。幾乎所有細(xì)胞被生長(zhǎng)因子、激素和有絲分裂原刺激后都會(huì)激活磷脂酶 C(phospholipase C，PLC)，水解 4，5-二磷酸磷脂酰肌醇產(chǎn)生三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)和二脂酰甘油(diacylglycerol，DAG)。IP3與其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的受體結(jié)合引起鈣離子的釋放，即受體操縱性 Ca2+內(nèi)流(receptor-operated Ca2+entry，ROCE)，這個(gè)過程還伴隨著跨細(xì)胞膜的鈣內(nèi)流［7］，被命名為鈣庫操縱性Ca2+內(nèi)流(store-operated Ca2+entry，SOCE)。其確切激活機(jī)制及涉及的通道尚需更多研究確認(rèn)。目前已明確的是鈣庫耗竭就能引起SOCE，在沒有IP3生成的情況下，肌漿網(wǎng)或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+泵的抑制劑毒蘿卜素可以通過耗竭鈣庫引起鈣內(nèi)流。但是其它鈣離子通道是通過下游的PLC激活，而與鈣庫耗竭沒有直接關(guān)系［8］。哺乳動(dòng)物TRP超家族成員被認(rèn)為在許多細(xì)胞內(nèi)組成PLC依賴性鈣離子內(nèi)流通路［9-12］。

PDGF作為重要的促有絲分裂原，與哮喘氣道重塑關(guān)系密切。PDGF主要由巨核細(xì)胞合成，其它如內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等亦可產(chǎn)生。它能作用于成纖維細(xì)胞，促進(jìn)其增殖，也能引起包括氣道平滑肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖。它通過與靶細(xì)胞膜上的PDGF受體結(jié)合，刺激多條信號(hào)通道:PLC通路，進(jìn)而通過Ca2+調(diào)節(jié)控制一系列的生理過程;PDGF可以增加花生四烯酸和前列腺素的合成和提高cAMP水平，導(dǎo)致DNA合成增加和細(xì)胞增殖。此外，PDGF還可以誘導(dǎo)一些與增殖有關(guān)的原癌基因的表達(dá)，例如 c-fos和 c-myc等［13］。PDGF還可以引起氣道平滑肌細(xì)胞表型的改變，促進(jìn)氣道重塑的發(fā)生。

本課題組在前期系列實(shí)驗(yàn)中建立了PDGF誘導(dǎo)氣道平滑肌細(xì)胞增殖的模型，在本實(shí)驗(yàn)中我們用20 μg/L PDGF成功誘導(dǎo)了ASMCs增殖，并確認(rèn)了TRPC6在ASMCs上有廣泛表達(dá)，可能主要存在于細(xì)胞漿。在此基礎(chǔ)上，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PDGF作用后TRPC6 mRNA和蛋白在ASMCs的表達(dá)明顯增加。這一結(jié)果與Yu等［2］在大鼠肺血管平滑肌上的研究結(jié)果一致，他們用PDGF誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的大鼠肺血管平滑肌增殖，檢測(cè)到PDGF上調(diào)了TRPC6 mRNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步用針對(duì)TRPC6設(shè)計(jì)的寡核苷酸鏈抑制TRPC6的表達(dá)后PDGF介導(dǎo)的肺血管平滑肌的增殖明顯被抑制，從而證明 TRPC6參與了PDGF誘導(dǎo)肺血管平滑肌細(xì)胞增殖的過程。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PDGF作用后，被認(rèn)為參與構(gòu)成ROCs的TRPC6的表達(dá)明顯增加，這說明ROCE有可能參與PDGF誘導(dǎo)的大鼠ASMCs增殖。Mukherjee等［14］發(fā)現(xiàn) PDGF作用在肺成纖維細(xì)胞上，通過IP3引發(fā)的鈣離子釋放引起胞漿內(nèi)鈣離子濃度的升高，這個(gè)過程中生成的DAG可直接激活TRPC6，所以推測(cè)TRPC6可能在PDGF誘導(dǎo)ASMCs的增殖中發(fā)揮了重要作用。

為了進(jìn)一步證實(shí)這個(gè)推論，我們用不同劑量的TRPC6阻斷劑與PDGF共同作用于ASMCs后，檢測(cè)PDGF誘導(dǎo)ASMCs增殖的作用是否發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:25μmol/L的TRPC6阻斷劑SKF96365單獨(dú)作用于ASMCs時(shí)未對(duì)ASMCs的增殖產(chǎn)生影響，但與PDGF共同處理細(xì)胞時(shí)，15μmol/L和25μmol/L SKF96365在24 h和48 h顯著降低了PDGF誘導(dǎo)的ASMCs增殖，5μmol/L SKF96365亦在作用48 h時(shí)顯著抑制了ASMCs的增殖。SKF96365作為TRPC阻 斷 劑，可 影 響 細(xì) 胞 內(nèi) 鈣 離 子 的 濃 度［2，15］。SKF96365阻斷了TRPC，使胞漿內(nèi)鈣離子濃度降低，從而導(dǎo)致增殖抑制，這提示TRPC6參與了PDGF誘導(dǎo)的氣道平滑肌細(xì)胞增殖過程。

本研究結(jié)果表明，PDGF上調(diào)TRPC6的表達(dá)，TRPC6阻斷劑SKF96365可引起PDGF誘導(dǎo)的ASMCs增殖減弱，提示 TRPC6參與了 PDGF誘導(dǎo)ASMCs增殖的過程，且這種過程可能與其影響胞漿內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)。尚需深入研究以進(jìn)一步明確TRPC6參與PDGF誘導(dǎo)的ASMCs增殖與胞漿內(nèi)鈣離子濃度這兩者之間的關(guān)系。