陸 紅， 胡麗萍， 洪 丹， 洪煒龍， 林成成， 王斯璐， 陳必成， 白永恒△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1醫(yī)學(xué)檢驗中心，3外科實驗室，浙江 溫州325000;2溫州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州325035)

馬兜鈴酸腎病(aristolochic acid nephropathy，AAN)是服用馬兜鈴酸(aristolochic acid，AA)類中草藥(如馬兜鈴、天仙藤、關(guān)木通等)引起的一類特殊的腎小管間質(zhì)損害，進而導(dǎo)致急、慢性腎功能衰竭［1］。體內(nèi)AAN主要病理表現(xiàn)為進行性腎間質(zhì)纖維化［2］，但AA如何引起間質(zhì)纖維化，其機制尚不清楚，且臨床上也無確實有效的治療藥物。垂盆草(Sedum sarmentosum Bunge，SSB)是一種景天科景天屬多年生草本植物，其提取物具有抑制炎性滲出和免疫調(diào)節(jié)的作用，可抵抗肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［3］。本文從體外實驗角度，觀察SSB提取物是否具有抗AA所致的腎小管間質(zhì)纖維化作用，并初步探討其可能的分子機制。

材料和方法

1 材料

1．1 試劑 馬兜鈴酸 I，購自 Sigma，純度97%，25 mg用50μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，再用DMEM細胞培養(yǎng)液(12．45 mL)稀釋成2 g/L原溶液;垂盆草提取物購自安徽宣城百草植物工貿(mào)公司，規(guī)格50∶1，1 g先用 DMSO 溶解(50 μL)，再用DMEM(9．95 mL)配成100 g/L原溶液;DMEM細胞培養(yǎng)液購自HyClone;胎牛血清購自杭州四季青生物公司;胰蛋白酶和TRIzol提取液購自Gibco;轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)ELISA檢測試劑盒購自上海西唐生物;兔抗鼠E-cadherin多克隆抗體購自Abcam;α-平滑肌肌動蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體購自 Santa Cruz;III型膠原多克隆抗體購自Bioworld;Dylight 488或594標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京康位生物公司;實時熒光定量PCR試劑購自Promega。

1．2 細胞 大鼠腎小管上皮細胞系NRK-52E購于中科院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1．3 儀器 MyCycler梯度 PCR儀，Bio-Rad產(chǎn)品;7500定量 PCR儀，Applied Biosystems產(chǎn)品;Varioskan Flash全波長多功能掃描儀，Thermo Scientific產(chǎn)品;DM4000 B LED熒光正置顯微鏡，Leica產(chǎn)品。

2 方法

2．1 大鼠腎小管上皮細胞的培養(yǎng)和處理 NRK-52E細胞置于含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。實驗時，將細胞按適當(dāng)濃度接種于6孔板中，待細胞70% ～80%融合時，換成無血清DMEM培養(yǎng)液并開始正式實驗。

2．2 對照溶劑實驗 實驗中藥物AA和SSB提取物均用溶劑DMSO溶解，故先評價DMSO對細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)累積和TGF-β1的影響。AA濃度為1～100 mg/L時DMSO使用體積為0．001～0．1 mL/L體系，而SSB提取物濃度為10～2 000 mg/L時DMSO體積為0．0005～0．1 mL/L體系。因此，DMSO 損傷實驗分為 0．001、0．01 和 0．1 mL/L 3組。對照溶劑實驗結(jié)果證實在本研究使用的不同濃度范圍內(nèi)DMSO對NRK-52E細胞的ECM累積和TGF-β1生成的影響并無顯著差異。

2．3 干預(yù)實驗分組 將實驗分成3組，分別為(1)溶劑對照組:不加 SSB和 AA，只加0．1μL DMSO;(2)AA損傷組:只加AA，濃度為1～100 mg/L;(3)SSB提取物干預(yù)組:在加入10 mg/L AA基礎(chǔ)上，同時加入SSB提取物(10～2 000 mg/L)。按照上述分組方案，加入相應(yīng)藥物，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。

2．4 ELISA檢測促纖維化因子TGF-β1含量 取對數(shù)生長期的NRK-52E細胞，以不同濃度AA(1～10 mg/L)和SSB提取物(10～2 000 mg/L)作用24 h，收集培養(yǎng)液。TGF-β1含量檢測采用雙抗體夾心ABCELISA法，即用抗大鼠 TGF-β1單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的TGF-β1與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠TGF-β1，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記的streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，于450 nm處測吸光度(A)，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出濃度。

2．5 實時熒光定量PCR檢測E-cadherin、α-SMA、骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein 7，BMP-7)和I型膠原mRNA的表達 采用TRIzol試劑提取已處理細胞中的RNA，于260和280 nm測定吸光度值以確定樣本純度和濃度。根據(jù)試劑說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。應(yīng)用 Primer 5．0軟件設(shè)計針對 E-cadherin、α-SMA、BMP-7和I型膠原mRNA特異性引物，以β-actin作為內(nèi)參照，采用相對定量法計算獲得結(jié)果。引物序列見表1，由上海捷瑞公司合成。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL進行PCR擴增，PCR擴增體系:5 μL 2×SYBR Green熒光定量試劑、2μL引物(上、下游各1μL，終濃度200 nmol/L)、2μL反應(yīng)緩沖液和1μL cDNA。擴增程序為:95℃ 5 min;95℃ 10 s，60℃ 35 s，40個循環(huán)。以熔解曲線評價PCR結(jié)果可靠性，2－ΔΔCt法計算相對 mRNA 表達量。ΔΔCt=［Ct目的基因(待測樣品)－ Ct內(nèi)參照(待測樣品)］－［Ct目的基因(校正樣品)－Ct內(nèi)參照(校正樣品)］。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1．Primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR

2．6 細胞免疫熒光染色檢測E-cadherin、α-SMA和III型膠原蛋白的表達 將細胞經(jīng)胰酶消化收集后，分別以2×105個細胞接種于含載玻片的6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)細胞至80% ～90%融合后，分別用AA和AA聯(lián)用SSB提取物進行處理24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗細胞3次，用4%多聚甲醛固定30 min，0．3%Triton X-100(1 mL/well)破膜，室溫20 min。0．5%正常山羊血清封閉。在各細胞爬片上滴加Ⅰ抗工作液，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次。滴加Dylight 488(綠色)或594(紅色)標(biāo)記的Ⅱ抗工作液，37℃孵育60 min，同上洗滌。細胞胞質(zhì)綠色或紅色為陽性著色。每組取3張片，每張片子取20個高倍視野(×400)，運用Image-Pro Plus 6．0軟件分析IA值。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13．0軟件包分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 倒置相差顯微鏡觀察損傷與干預(yù)前后NRK-52E細胞形態(tài)學(xué)的影響

如圖1所示，正常情況下，NRK-52E細胞培養(yǎng)24 h后，細胞密度極高，細胞間接觸緊密;由于接觸抑制，細胞形態(tài)小、排列成鋪路石狀。用不同濃度的AA作用后，細胞數(shù)量下降，細胞損傷表現(xiàn)明顯，失去貼壁作用，細胞漂浮在培養(yǎng)液中;細胞形態(tài)變大，出現(xiàn)纖維細胞樣改變(梭狀)。用SSB提取物干預(yù)后，AA所致的損傷作用大幅減輕，細胞數(shù)量下降不明顯，且細胞形態(tài)逐漸恢復(fù)正常。

Figure 1．Morphological changes of NRK-52E cells observed under inverted phase-contrast microscope(×200)．圖1 倒置相差顯微鏡觀察NRK-52E細胞的形態(tài)改變

2 SSB提取物對AA誘導(dǎo)的ECM累積的影響

纖維化的病理表現(xiàn)為大量ECM成分如I型和III型膠原在損傷局部的累積過程。我們通過細胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，DMSO損傷組中各濃度之間表達I型和III型膠原無明顯差異;10 mg/L AA作用NRK-52E細胞后，其表達的III型膠原明顯增多，見圖2。同樣，實時熒光定量PCR結(jié)果也顯示I型膠原mRNA的表達隨著AA濃度的增加而增高，見圖3A。在10 mg/L AA基礎(chǔ)上用SSB提取物進行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度的SSB提取物(10 mg/L)對膠原形成的影響不明顯，但中高濃度的SSB提取物(100和1 000 mg/L)能明顯降低I型膠原mRNA和III型膠原蛋白的表達水平，見圖2、3B。這些結(jié)果提示一定濃度的SSB提取物能抑制AA所致的纖維化樣效應(yīng)。

Figure 2．Expression of type III collagen in NRK-52E cells induced by AA with or without SSB extract treatment(×200)．圖2 AA對NRK-52E細胞中III型膠原蛋白表達的影響及SSB提取物的干預(yù)作用

Figure 3．The mRNA expression of type I collagen in NRK-52E cells induced by AA with or without SSB extract treatment．Mean ±SD．n=10．*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs control;#P ＜0．05 vs AA(10 mg/L)．圖3 AA對NRK-52E細胞I型膠原mRNA表達的影響及SSB提取物的干預(yù)作用

3 SSB對AA誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化的影響

細胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，10 mg/L AA作用于NRK-52E細胞，E-cadherin蛋白表達下調(diào)，而α-SMA蛋白表達上調(diào)，見圖4。此外，實時熒光定量PCR結(jié)果同樣顯示E-cadherin mRNA表達明顯下降，α-SMA mRNA表達明顯增加，且上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)抑制分子 BMP-7 mRNA表達也下調(diào)(P＜0．05)，見圖5。這些結(jié)果提示AA誘導(dǎo)小管上皮細胞膠原累積過程中出現(xiàn)EMT效應(yīng)。通過SSB提取物的干預(yù)作用，上述改變呈現(xiàn)相反的趨勢，見圖4、5，說明SSB提取物可抑制AA誘導(dǎo)的EMT進程。

Figure 4．Expression of E-cadherin andα-SMA in NRK-52E cells induced by AA with or without SSB extract treatment(×200)．圖4 AA對NRK-52E細胞E-cadherin和α-SMA表達的影響及SSB提取物的干預(yù)作用

Figure 5．Effects of SSB extract on mRNA expression of EMT-related genes in NRK-52E cells induced by AA．Mean±SD．n=6．*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01 vs control．圖5 SSB提取物對AA誘導(dǎo)的NRK-52E細胞EMT相關(guān)基因mRNA表達的影響

4 SSB提取物影響TGF-β1的表達水平

DMSO損傷實驗中，各組細胞間產(chǎn)生TGF-β1量無明顯差異。在低于10 mg/L AA作用NRK-52E細胞后，細胞分泌TGF-β1量呈現(xiàn)濃度依賴性，即隨著AA濃度增高，TGF-β1表達量逐漸增多，到AA濃度為10 mg/L 時達峰值［(603．4 ±30．1)ng/L］。應(yīng)用SSB提取物干預(yù)10 mg/L AA后，隨著SSB提取物濃度從10 mg/L增加到2 000 mg/L，TGF-β1分泌量下降到(257．9 ±19．8)ng/L，見圖 6，提示 SSB 提取物具有抑制TGF-β1表達的作用。

Figure 6．The level of TGF-β1 in NRK-52E cells determined by ELISA．圖6 ELISA檢測NRK-52E細胞中TGF-β1水平改變

討 論

在體內(nèi)，AAN主要表現(xiàn)為廣泛的間質(zhì)纖維化，同時伴有腎小管萎縮及腎小管消失等病理改變［2］。臨床上AA引起的腎纖維化具有不可逆性，同時缺乏有效的治療藥物，病人常常以腎衰竭和尿毒癥為結(jié)局。因此，積極探索AA所致腎纖維化的分子機制，并給予有效的早期干預(yù)，對于AAN病人具有十分重要的意義。我們前期研究顯示，AA可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡，并活化Sonic hedgehog信號，促使ECM成分(如I型和III型膠原)在損傷局部廣泛累積，從而導(dǎo)致纖維化的發(fā)生［4］。本研究中，AA促進了 α-SMA表達，抑制E-cadherin表達，并下調(diào)了BMP-7 mRNA的表達。這些結(jié)果提示腎小管上皮細胞遭受AA損傷后，形成了對損傷微環(huán)境更為耐受的肌成纖維細胞，即EMT效應(yīng)。此外，研究也發(fā)現(xiàn)，在AA損傷腎小管上皮細胞過程中，TGF-β1的表達明顯升高。TGF-β1是目前公認的較強的促纖維化因子，同時也是EMT過程重要的調(diào)節(jié)分子。Yang等［5］研究顯示，AA損傷細胞DNA，導(dǎo)致細胞生長阻滯在G2/M期，進而引起JNK信號的活化，促進了TGF-β1的表達。TGF-β1的高表達不僅促進EMT進程，也促進了膠原的累積，最終引起纖維化［6］。

垂盆草又名地蜈蚣草，其化學(xué)成分有N-甲基異石榴皮堿(N-methylisopelletierine)、二氫-N-甲基異石榴皮堿、景天庚酮糖(sedoheptulose)、葡萄糖、果糖、蔗糖等。此藥性涼，味甘、淡，新鮮或干燥全草入藥，主要用于治療濕熱黃疽、小便不利、癰腫瘡瘍。有研究表明，垂盆草的提取物能抑制炎性滲出、減少肝細胞損傷、降低血清丙基酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平，具有治療急、慢性肝炎和抗癌等功效［7-8］。然而目前尚不清楚SSB提取物能否抑制AA所致的腎小管上皮細胞損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):濃度為100～1 000 mg/L SSB提取物能明顯降低I型和III型膠原的表達水平，提示一定濃度的SSB提取物具有潛在的抗纖維化作用。此外，我們還觀察到SSB提取物能下調(diào)α-SMA的表達，并促進E-cadherin表達。這些結(jié)果提示SSB提取物可抑制小管上皮細胞的EMT進程。同時，SSB提取物也抑制了小管上皮細胞分泌和表達TGF-β1，通過下調(diào)TGF-β1表達，進而延緩腎小管上皮細胞產(chǎn)生膠原的進程。

綜上所述，我們通過體外實驗初步闡明AA可促進TGF-β1表達、腎小管上皮細胞EMT進程以及膠原累積，并且AA所致的上述這些纖維化效應(yīng)可被SSB提取物拮抗。因此，SSB提取物可能具有潛在的抗纖維化作用。但SSB提取物如何發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化作用，其確實的效應(yīng)尚需體內(nèi)實驗和更深入的分子機制研究加以證實和明確。