李華波， 陳世健， 胡建華

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院心內(nèi)科，湖北恩施445000)

兒茶酚抑素(catestatin，CST)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型內(nèi)源性血管活性多肽，其前體嗜鉻蛋白顆粒A與兒茶酚胺類激素在腎上腺嗜鉻細(xì)胞及腎上腺能神經(jīng)元胞漿中共同儲(chǔ)存和釋放。既往研究表明CST具有直接及間接抑制兒茶酚胺類激素分泌的作用［1-2］。慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是心血管系統(tǒng)常見疾病，隨著人口老年化及壽命的提高，CHF發(fā)病率也隨之升高。兒茶酚胺類激素可作用于心臟β受體而在CHF發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，此外，循證醫(yī)學(xué)證實(shí)β受體阻滯劑是目前唯一能降低心律失?；颊呖偹劳雎实目剐穆墒СＫ幬铮?］。由此提示我們，直接作用于兒茶酚胺類激素分泌階段的CST或許具有抗心律失常作用，為驗(yàn)證這一猜想，我們開展了本次研究。

材料和方法

1 動(dòng)物給藥及分組

實(shí)驗(yàn)用雄性SD大鼠51只，體重200～250 mg，由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)將動(dòng)物分為對(duì)照(control，CTL)組(n=17)和 CHF組(n=34)。CHF組給予連續(xù)7 d注射異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO;5 mg·kg－1·d－1，ip;Sigma)制備CHF 模型［4］，CTL 組則注射 0．9%生理鹽水(1 mL·kg－1·d－1，ip)。模型制備完成后，將 CHF 組再隨機(jī)分為未治療組(n=17)和CHF治療組(CST組;n=17)。治療組動(dòng)物給予連續(xù)3周注射CST(2 nmol·kg－1·d－1，ip;Sigma)進(jìn)行治療，未治療組則注射0．9%生理鹽水(1 mL·kg－1·d－1，ip)。完成分組后，在動(dòng)物給藥及飼養(yǎng)過(guò)程中未出現(xiàn)死亡。

2 方法

2．1 心臟超聲檢查 CHF模型制備完成2周后，行超聲心動(dòng)圖檢查評(píng)價(jià)造模結(jié)果。大鼠以3%戊巴比妥鈉溶液(60 mg/kg;Sigma)行腹腔注射麻醉，胸部脫毛后固定于仰臥位，連接肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖，使用心臟超聲診斷系統(tǒng)(Vivid 7型，GE)行心臟超聲檢查，S4線控探頭，圖像深度調(diào)制 3．0～5．0 cm，頻率為7.5 MHz。通過(guò)M型超聲獲得舒張期室間隔厚度(interventricular septal thickness in diastole，IVSd)及左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in diastole，LVPWd);在心尖四腔心切面測(cè)量左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)及左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular endsystolic diameter，IVESD);左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)根據(jù)改良的Simpon公式計(jì)算獲得。

2．2 整體心臟離體電生理研究 3組動(dòng)物各選取14只進(jìn)行離體心臟灌流，每組剩下的3只動(dòng)物用于膜片鉗研究。以3%戊巴比妥鈉溶液(60 mg/kg)行腹腔注射麻醉，開胸取出心臟連接于Langendorff心臟灌流裝置經(jīng)主動(dòng)脈逆行灌流，所有動(dòng)物均給予普通Tyrode’s液灌流，灌流液保持37℃恒溫，灌流速度6～8 mL/min，從取出心臟到實(shí)現(xiàn)灌流在2 min內(nèi)完成。具體操作步驟及灌流液要求參照文獻(xiàn)［5-6］。本實(shí)驗(yàn)中，1對(duì)鉑金刺激電極(兩電極間距為1 mm)連接于LEAD2000B多道電生理儀(四川錦江通用實(shí)業(yè)有限公司)，參照文獻(xiàn)［7］用外殼包被有聚四氟乙烯的銀絲(直徑0．3 mm)自制非極化Ag-AgCl單相動(dòng)作電位(monophasic action potential，MAP)記錄雙極電極。

2．2．1 記錄MAP 將刺激電極置于左室前游離壁(left anterior free wall，LAF;左前降支左側(cè) 0．5 cm處，左室前壁正中水平)心外膜行基礎(chǔ)周長(zhǎng)為300 ms的S1S1刺激(脈寬2 ms、刺激強(qiáng)度為舒張期起搏閾值的2倍)，記錄電極置于刺激電極周圍1～2 cm處記錄MAP。待MAP圖形穩(wěn)定后選擇5個(gè)連續(xù)的MAP波形，應(yīng)用Chart 7．0軟件測(cè)量90%單相動(dòng)作電位時(shí)程(90%of MAP duration，MAPD90)。

2．2．2 測(cè)量心室有效不應(yīng)期(ventricular effective refractory period，VERP) 刺激電極置于LAF行程控電刺激，記錄電極置于刺激電極周圍1～2 cm測(cè)定ERP。在連續(xù)發(fā)放8個(gè)起搏刺激波S1后發(fā)放早搏刺激波 S2(S1S1=300 ms，S1S2=300 ms，刺激強(qiáng)度為舒張期起搏閾值的2倍)，S1S2間期自300 ms開始每次減少20 ms直至S1S2=100 ms，隨后以每次減少10 ms的幅度降低S1S2間期，如S2能誘發(fā)出動(dòng)作電位，則繼續(xù)降低S1S2間期10 ms;如S2不能誘發(fā)出動(dòng)作電位，則將S1S2增加10 ms，然后以－1 ms反掃直至S2不能誘發(fā)出動(dòng)作電位。此時(shí)的S1S2間期即基礎(chǔ)周長(zhǎng)為300 ms時(shí)LAF的VERP。

2．2．3 動(dòng)作電位時(shí)程(action potential duration，APD)電交替(alternans，ALT)及室性心律失常(ventricular arrhythmia，VA)的誘發(fā) (1)APD-ALT的誘發(fā):于LAF處行程控S1S1增頻電刺激(刺激強(qiáng)度為舒張期起搏閾值的2倍，脈寬2 ms)，記錄電極置于刺激電極周圍1～2 cm。初始起搏周長(zhǎng)(pacing cycle length，PCL)為 300 ms，S1S1間期自 300 ms開始每次減少20 ms直至S1S1=140 ms，隨后以每次減少10 ms依次遞減10 ms直至出現(xiàn)電交替。每次刺激持續(xù)30 s，2次刺激間休息30 s。APD-ALT定義為快頻率刺激下標(biāo)測(cè)部位連續(xù)2個(gè)動(dòng)作電位的時(shí)程呈長(zhǎng)短交替［8］。(2)VA 的誘發(fā):行 Burst刺激誘發(fā) VA，將刺激電極置于LAF，給予50 Hz持續(xù)時(shí)間2 s的Train刺激，總刺激時(shí)間小于2 min。VA持續(xù)時(shí)間超過(guò)2 s即記為VA可誘發(fā)，超過(guò)30 s即記為持續(xù)性VA［9］。

2．3 全細(xì)胞膜片鉗記錄

2．3．1 大鼠心室肌細(xì)胞分離 將各組剩下的3只動(dòng)物用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究。經(jīng)腹腔注射肝素(3 000 U/kg)使大鼠肝素化，10 min后頸椎脫臼法處死，迅速取出心臟，連接于Langendorff心臟灌流裝置，行主動(dòng)脈逆行灌流。先用含0．2 g/L乙二胺四乙酸(EDTA)的無(wú)鈣Tyrode’s液灌流5 min，隨后用含有膠原酶Ⅰ和蛋白酶E(Sigma)的無(wú)鈣Tyrode’s液灌流，所有灌流速度為8 mL/min，待心臟膨大蓬松時(shí)停止灌流。取下心臟，剪取LAF置于2 mL含0．1%小牛血清蛋白的無(wú)鈣Tyrode’s液中剪碎，稀釋至50 mL后置于37℃恒溫水浴箱中孵化，10 min后用尼龍網(wǎng)過(guò)濾收集心室肌細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞懸液在室溫下孵育1 h后備用。具體液體配方及操作步驟參照文獻(xiàn)［10］。

2．3．2 ICa-L記錄及峰電流的測(cè)定 全細(xì)胞膜片鉗采用EPC-9放大器和Pulse+Pulsefit 8．8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和分析。將細(xì)胞置于灌流槽內(nèi)經(jīng)無(wú)鈣Tyrode’s液持續(xù)恒溫灌流(2 mL/min)。電極阻抗3～5 MΩ并充灌細(xì)胞內(nèi)液 (mmol/L:CsCl 120，CaCl21，MgCl25，HEPES10，EDTA 11，葡萄糖11，Na2ATP 5，pH值用CsOH調(diào)整至7．3)，串聯(lián)電阻控制在4～8 MΩ。室溫控制在22～25℃。高倍鏡下選擇橫紋清晰、邊緣整齊、表面無(wú)顆粒、無(wú)收縮的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。在電壓鉗模式下，將保持電壓維持在－40 mV使Na+通道及T型Ca2+通道失活，將命令電壓從－40 mV逐步除極至60 mV，階躍+10 mV，時(shí)程150 ms，記錄不同鉗制電壓下的L型鈣通道電流(L-type Ca2+current，ICa-L)強(qiáng)度，最大的 ICa-L即為 ICa-L峰電流。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，正態(tài)分布計(jì)量資料兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示;誘發(fā)APD-ALT的 PCL用中位數(shù)描述，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，結(jié)果以率和構(gòu)成比表示，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CTL組和CHF組超聲結(jié)果比較

與CTL組相比，CHF組 LVEF、LVFS、IVSd和LVPWd均明顯減小(均 P＜0．01)，而 LVEDD和LVESD則明顯增大(均P＜0．01)，表明CHF模型制備成功，見表1。

2 3組大鼠I Ca-L峰電流比較

與CTL組相比，未治療組ICa-L峰電流密度增強(qiáng)(P＜0．01);在給予CST治療后，CST組ICa-L峰電流密度較未治療組明顯縮小(P＜0．01)，且與CTL組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P＞0．05)，說(shuō)明CST治療可以抑制CHF時(shí)過(guò)度激活的L型Ca2+電流，見圖1和表2。

表1 CTL組與CHF組超聲指標(biāo)的比較Table 1．Echocardiographic parameters in CTL and CHF groups(Mean±SD)

Figure 1．L-type Ca2+current in CTL，non-treatment and CST groups．圖1 3組動(dòng)物L(fēng)型Ca2+電流的比較

3 3組大鼠 VERP、MAPD90及 VERP/MAPD90的比較

與CTL組相比，未治療組MAPD90及VERP均增大(均 P ＜0．01)，但 VERP/MAPD90減小(P ＜0．01)。在給予CST治療后，CST組上述指標(biāo)雖未恢復(fù)到CTL組水平，但MAPD90及VERP均較未治療組明顯減小(均P＜0．01)，而 VERP/MAPD90卻較未治療組增大(P＜0．01)，提示CST治療對(duì)CHF大鼠電重構(gòu)可以起到一定的改善作用，見圖2和表2。

4 3組大鼠APD-ALT及VA的誘發(fā)結(jié)果

與CTL組相比，未治療組誘發(fā)APD-ALT最大起搏周長(zhǎng)(PCLmax)中位數(shù)及VA誘發(fā)率均顯著增大(均P＜0．01);在給予 CST治療后，CST組誘發(fā) APDALT的PCLmax中位數(shù)及VA誘發(fā)率均較未治療組減小(均P＜0．05)，且與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異(均P＞0．05)，說(shuō)明CST治療可以增加 CHF大鼠 APDALT的誘發(fā)閾值及降低VA的誘發(fā)率，提示CST具有一定的抗心律失常作用，見圖3、4和表2。

Figure 2．Action potential duration in CTL，non-treatment and CST groups．圖2 3組動(dòng)物動(dòng)作電位時(shí)程的比較

Figure 3．The induced APD-ALT in CTL，non-treatment and CST groups．圖3 各組動(dòng)物動(dòng)作電位時(shí)程電交替誘發(fā)結(jié)果

Figure 4． The induced VA in CTL，non-treatment and CST groups．圖4 各組大鼠室性心律失常誘發(fā)結(jié)果

表2 各組大鼠相關(guān)電生理指標(biāo)結(jié)果的比較Table 2．Electrophysiological parameters in CTL，non-treatment and CST groups(Mean±SD．n=14)

討 論

CHF患者存在心肌結(jié)構(gòu)重塑的同時(shí)還常常伴有電學(xué)重構(gòu)，而心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)又可導(dǎo)致CHF并發(fā)各種心律失常，其中VA尤為常見。流行病學(xué)顯示我國(guó)每年約有54萬(wàn)人死于心源性猝死，而VA是引起心源性猝死的主要原因［11］。既往研究提示現(xiàn)有的針對(duì)單一離子通道的抗心律失常藥物并不能降低患者總死亡率，有的甚至增加患者的死亡率［12］，因此尋找新的抗心律失常藥物一直是心血管病研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的一些學(xué)者提出將離子通道上游調(diào)控因素(如自主神經(jīng)及其遞質(zhì)和心臟相關(guān)受體等)作為抗心律失常藥物作用的新靶點(diǎn)。嗜鉻顆粒蛋白A是CST前體，其在體內(nèi)可分解為CST和血管抑制素1(vasostatin-1)兩種產(chǎn)物。已有研究證實(shí)血管抑制素能發(fā)揮類似抑制心臟自主神經(jīng)的作用，從而抑制心房顫動(dòng)的發(fā)生［13］。CST同樣具有顯著抑制兒茶酚胺類激素分泌從而發(fā)揮類似抑制心臟交感神經(jīng)的作用，而CST是否具有抗心律失常的作用既往并無(wú)相關(guān)研究。

既往研究表明ISO可導(dǎo)致心肌細(xì)胞溶解性壞死，并最終引起心肌重構(gòu)、室壁變薄及心腔擴(kuò)大等類似慢性心力衰竭的表現(xiàn)［14］。本研究采用腹腔注射ISO的方法制備CHF模型，經(jīng)超聲心動(dòng)圖結(jié)果證實(shí)CHF模型制備成功。ISO誘導(dǎo)的CHF模型，一方面不存在持續(xù)性損傷因素，更能模擬CHF的病理生理過(guò)程，另一方面在制備模型過(guò)程中所有動(dòng)物均未出現(xiàn)死亡，與以往通過(guò)手術(shù)方式制備的CHF模型相比，大大降低了動(dòng)物死亡率。本研究再次證實(shí)該方法制備CHF模型是方便可行安全的。

在本研究結(jié)果中未治療組MAPD90和 VERP均較CTL組明顯延長(zhǎng)，但 VERP延長(zhǎng)程度小于MAPD90，這導(dǎo)致 VERP/MAPD90比值減小。VERP/MAPD90比值大小是一個(gè)反映心肌細(xì)胞電穩(wěn)定性的指標(biāo)，其比值越小，心肌細(xì)胞由于后除極引起VA的機(jī)率越大，即心肌細(xì)胞的電穩(wěn)定性越差［15］。在給予CST治療后CHF大鼠VERP/MAPD90比值較未治療組明顯增加，這可能是CST組VA誘發(fā)率較未治療組減低的一個(gè)原因。

在給予S1S1程控增頻刺激的過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)，未治療組誘發(fā)APD-ALT的PCLmax中位數(shù)也較CTL組和CST組均明顯增大，即誘發(fā)APD-ALT的頻率閾值下降。APD-ALT指的是快頻率刺激下相鄰2次APD的復(fù)極時(shí)間呈現(xiàn)長(zhǎng)短交替的現(xiàn)象，其常被視作是惡性心律失常發(fā)生的預(yù)測(cè)指標(biāo)［16］。雖然 APDALT的發(fā)生機(jī)制目前尚不十分明確，但有證據(jù)顯示心臟鈣離子流改變?cè)贏PD-ALT的發(fā)生中起重要作用。Fox等［17］的研究結(jié)果顯示抑制L型Ca2+通道可以抑制APD-ALT的發(fā)生，反之則促進(jìn)APD-ALT。在本研究中，CHF未治療組ICa-L峰電流密度較CTL組明顯增強(qiáng)(P＜0．01)，而在給予CST治療后CST組ICa-L峰電流密度較未治療組明顯減小(P＜0．01)，且與CTL組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。因此，CST治療引起CHF大鼠ICa-L峰電流密度減小進(jìn)而抑制APD-ALT發(fā)生，是CST組VA誘發(fā)率較未治療組減低的另一個(gè)原因。