馬義才， 侯 飛，王春英

(電子科技大學 生命科學與技術學院，成都 610054)

量子點免疫層析試條定量檢測系統(tǒng)的設計

馬義才*， 侯 飛，王春英

(電子科技大學 生命科學與技術學院，成都 610054)

一種量子點免疫層析試條定量檢測系統(tǒng)，由量子點免疫層析試條、試條架、掃描系統(tǒng)、電荷耦合器(CCD)、信號放大器、模/數(shù)轉(zhuǎn)換器(A/D)、微處理器(MCU)、輸出顯示裝置、打印機、鍵盤和一張與試條配套的IC卡構(gòu)成。微處理器讀取IC卡參數(shù)后控制試條架運動以適合掃描系統(tǒng)的光纖探頭對試條進行自動掃描，采集的特征波長反射熒光經(jīng)CCD、信號放大器、模/數(shù)轉(zhuǎn)換器傳輸給微處理器進行光信號識別和濃度計算，輸出顯示裝置顯示結(jié)果。該系統(tǒng)能快速準確實現(xiàn)樣品多元指標定量檢測，具有檢測快速、靈敏度高、結(jié)果客觀、使用靈活等特點，在生物醫(yī)學樣品檢測方面具有廣泛應用前景。

量子點；定量檢測系統(tǒng)；免疫層析試條；電荷耦合器；設計

圖1 基于CCD的量子點免疫層析試條定量檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)框圖

圖2 量子點免疫層析試條結(jié)構(gòu)

生物醫(yī)學樣品多元指標快速同步定量檢測，一直是本領域亟需解決而未能解決的問題。近年發(fā)展的量子點(Quantum Dot，QD)納米顆?？擅馐苋軇└蓴_，熒光發(fā)射強而穩(wěn)定，已成為生物分子標記的新熱點[1-8]。本文介紹一種基于CCD的量子點免疫層析試條定量檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)能快速準確實現(xiàn)樣品多元指標定量檢測。

1 系統(tǒng)設計

1.1系統(tǒng)結(jié)構(gòu)組成

量子點免疫層析試條定量檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)見圖1，包括量子點免疫層析試條、試條架、掃描系統(tǒng)、電荷耦合器(CCD)、信號放大器、模/數(shù)轉(zhuǎn)換器(A/D)、微處理器(MCU)、輸出顯示裝置、打印機、鍵盤和一張與試條配套的IC卡。

1)試條及試條架。圖2為本系統(tǒng)量子點免疫層析試條結(jié)構(gòu)。試條順次設有相互搭接粘貼的樣品墊、玻璃纖維膜結(jié)合墊、具有檢測帶和質(zhì)控帶的硝酸纖維分析膜、強吸水墊、試條反應終點指示標簽和試條辨識標簽。玻璃纖維膜結(jié)合墊包被有量子點免疫結(jié)合物，試條的檢測帶包被有被檢物特異抗體或抗原，質(zhì)控帶包被有二抗質(zhì)控物。待測樣品(如血清或尿液) 施加到試條一端的樣品墊上后, 樣品中待測物組分利用試條毛細管作用慢慢向試條后端滲移，若樣品中有被檢物抗原或抗體，它們便與試條玻璃纖維膜結(jié)合墊上的量子點免疫結(jié)合物結(jié)合后繼續(xù)滲移至試條檢測帶，與檢測帶包被的相應抗體或抗原發(fā)生特異性結(jié)合而被截留富集在檢測帶上，富集的量子點的量與樣品中待測物含量成正比，通過檢測量子點反射熒光信號強度即可確定待測物質(zhì)量濃度。游離量子點免疫結(jié)合物則越過檢測帶，與包被在質(zhì)控帶的二抗反應。質(zhì)控帶用于試條質(zhì)量控制和監(jiān)測試條反應成敗。試條架用于放置施加有待測樣品的量子點免疫層析試條。

2)掃描系統(tǒng)包括一激發(fā)光源。在該激發(fā)光源的輸出光路上依次為入射光耦合器、入射光纖、光纖探頭、出射光纖、出射光耦合器，直至CCD。激發(fā)光源為發(fā)光二極管LED或激光二極管。光纖探頭合束共用，其中心為入射光纖，周緣為出射光纖。

3) CCD及信號放大器。CCD位于出射光耦合器像面上，其輸出端經(jīng)信號放大器與A/D相連。CCD收集試條檢測帶和質(zhì)控帶反射來的特征波長熒光信號，將其轉(zhuǎn)換為電信號后由信號放大器放大。

4)A/D轉(zhuǎn)換器的輸入端與信號放大器的輸出端相連，其輸出端與MCU的輸入端相連。

5)MCU 采集、存儲A/D傳輸來的數(shù)字信號，并對數(shù)字信號進行數(shù)據(jù)處理。MCU配有輸出顯示裝置、打印機、鍵盤和一張與試條相配套的IC卡，它們分別與MCU相連。MCU與試條架之間還有一個驅(qū)動控制電路，該電路能使定量檢測系統(tǒng)通過MCU讀取IC卡上的參數(shù)后發(fā)出指令從而自動控制試條架運動以適合掃描系統(tǒng)發(fā)出的光能對試條檢測帶和質(zhì)控帶進行自動掃描。

6)輸出顯示裝置可以為上位機、字母數(shù)字LCD、LED或聲音等。系統(tǒng)配合不同的輸出顯示裝置，實現(xiàn)樣品多指標定量或定性檢測：當系統(tǒng)用于樣品定量檢測時，輸出顯示裝置可采用上位機或字母數(shù)字LCD；當系統(tǒng)用于樣品定性檢測時，輸出顯示裝置可采用LED或聲音。

7)IC卡用于貯存被檢物檢測標準曲線、試條質(zhì)控帶光密度參考監(jiān)控值及檢測者的相關信息。IC卡與MCU之間采用USB串口通訊。樣品檢測時，IC卡能適時插拔。

樣品檢測時，加有待檢樣品的量子點免疫層析試條置于試條架的試條槽內(nèi)。光源發(fā)出的光經(jīng)入射光耦合器進入入射光纖，入射光纖分2束經(jīng)光纖探頭分別照射到試條檢測帶和質(zhì)控帶上以激發(fā)檢測帶和質(zhì)控帶上的量子點免疫復合物發(fā)出特征波長反射熒光，2束反射熒光分別經(jīng)檢測帶和質(zhì)控帶相對應的出射光纖、出射光耦合器后被CCD接收，CCD將光信號轉(zhuǎn)換為電信號并放大后傳輸給A/D轉(zhuǎn)換器，A/D轉(zhuǎn)換器將放大后的電信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號后傳輸給MCU進行存儲和數(shù)據(jù)處理，獲得各被檢物檢測帶光密度值(OD檢測帶)和質(zhì)控帶光密度值(OD質(zhì)控帶)，進而計算得到OD檢測帶/OD質(zhì)控帶比值或OD檢測帶/(OD檢測帶+OD質(zhì)控帶)比值，并自動根據(jù)IC卡上存貯的相應被檢物標準曲線分析計算出被檢物濃度，之后將檢測結(jié)果傳輸給輸出顯示裝置，完成整個檢測過程。

1.2 量子點免疫層析試條制作

1.2.1 試條組件制備

1)樣品墊。纖維素膜切成一定規(guī)格膜塊，將其放入樣品墊處理液(pH=7.2，0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液+5%BSA+0.1%Tween 20)中浸泡，取出，烘干。

2)結(jié)合墊。玻璃纖維膜切成一定規(guī)格膜塊，在該膜塊上加上量子點與被檢物特異抗體或抗原的結(jié)合物溶液(即量子點免疫結(jié)合物溶液)，烘干膜塊。

3)分析膜。硝酸纖維素膜切成一定規(guī)格膜塊，在該膜塊上相隔一定距離分別噴點被檢物特異抗體或抗原作為檢測帶和噴點二抗質(zhì)控物作質(zhì)控帶，烘干膜塊。

4)強吸水墊。纖維素膜切成一定規(guī)格膜塊，干燥備用。

5)試條反應終點指示標簽。選用變色范圍為5.0～9.0的精密pH試紙，切成一定規(guī)格膜塊，干燥備用。

6)試條辯識標簽。選用印制有試條標識的標簽紙并切成一定規(guī)格膜塊，干燥備用。

1.2.2 試條裝配

制備好的試條各組件按樣品墊、玻璃纖維膜結(jié)合墊、分析膜、強吸水墊、試條反應終點指示標簽、試條辯識標簽順次相互搭接粘于塑料襯墊上，剪切成一定規(guī)格試條。

1.3 被檢物標準曲線制備與存貯

1.3.1 被檢物標準曲線制備

1)配制被檢物標準品系列質(zhì)量濃度。2)將各標準品系列質(zhì)量濃度置于本系統(tǒng)測得相應OD檢測帶和OD質(zhì)控帶并分別計算出OD檢測帶/OD質(zhì)控帶比值或OD檢測帶/(OD檢測帶+OD質(zhì)控帶)比值。3)以各標準品系列質(zhì)量濃度作X軸，測試結(jié)果以OD檢測帶/OD質(zhì)控帶比值或OD檢測帶/(OD檢測帶+OD質(zhì)控帶)比值作Y軸，繪制標準曲線。

圖3 乙肝表面抗原(HBsAg)標準曲線(示單項檢測)

圖4 血清腫瘤標志物AFP、CEA和PSA標準曲線(示一檢多項)

圖5 量子點標記的乙肝表面抗原(HBsAg)熒光光譜(示單項檢測)

圖6 量子點標記的血清腫瘤標志物AFP、CEA和PSA熒光光譜(示一檢多項)

圖3為乙肝表面抗原(HBsAg)標準曲線(示單項檢測，其中：X軸為HBsAg標準品系列質(zhì)量濃度；Y軸為HBsAg標準品系列)。制備方法：1)HBsAg標準品系列質(zhì)量濃度配制。用1∶10稀釋的正常人血清(以pH=7.2，0.03 mol/L PB緩沖液稀釋)作稀釋液，將HBsAg標準品配成系列質(zhì)量濃度20份：0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1 100、1 200、1 300、1 400、1500、1 600、1 700、1 800、1 900 pg/mL。2)繪制HBsAg標準曲線。上述每一HBsAg標準品系列質(zhì)量濃度分別用10條量子點標記的HBsAg免疫層析試條于相同條件下檢測10次，分別讀得其檢測帶光密度值(OD檢測帶)與質(zhì)控帶光密度值(OD質(zhì)控帶)，計算平均值和OD檢測帶/(OD檢測帶+OD質(zhì)控帶)比值。以HBsAg標準品系列質(zhì)量濃度作X軸，以每一HBsAg標準品系列質(zhì)量濃度對應求得的OD檢測帶/(OD檢測帶+OD質(zhì)控帶)比值作Y軸繪制標準曲線。

圖4為血清腫瘤標志物甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)和前列腺特異抗原(PSA)標準曲線(示一檢多項，其中：X軸為AFP、CEA和PSA標準品系列質(zhì)量濃度；Y軸為AFP、CEA和PSA標準品系列質(zhì)量濃度對應求得的OD檢測帶/OD質(zhì)控帶比值)。制備方法：1)標準品系列質(zhì)量濃度配制。用1∶10稀釋的正常人血清(以pH=7.2， 0.03 mol/L PB緩沖液稀釋)作稀釋液，將AFP、CEA和PSA標準品分別按0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000、1 100、1 200、1 300、1 400、1 500、1 600、1 700、1 800、1 900 pg/mL配成系列質(zhì)量濃度各20份。2)繪制腫瘤標志物標準曲線。每份腫瘤標志物標準品系列質(zhì)量濃度分別用10條量子點標記的腫瘤標志物一檢多項免疫層析試條在相同條件下檢測10次，分別讀得其檢測帶光密度值(OD檢測帶)與質(zhì)控帶光密度值(OD質(zhì)控帶)，得到平均值和OD檢測帶/OD質(zhì)控帶比值。以每一腫瘤標志物標準品系列質(zhì)量濃度作X軸，以各腫瘤標志物標準品系列質(zhì)量濃度對應求得的OD檢測帶/OD質(zhì)控帶比值作Y軸繪制標準曲線。

1.3.2 被檢物標準曲線存貯

編寫標準曲線軟件。將該標準曲線軟件與試條質(zhì)控帶光密度參考監(jiān)控值(即標準曲線制作時得到的試條質(zhì)控帶光密度值OD質(zhì)控帶)存貯于IC卡上。圖5為量子點標記的HBsAg熒光光譜：I為檢測帶的HBsAg光譜峰，Ⅱ為質(zhì)控帶的質(zhì)控物光譜峰。圖6為量子點標記的血清腫瘤標志物AFP、CEA和PSA熒光光譜：Ⅰ為檢測帶的AFP光譜峰，Ⅱ為檢測帶的CEA光譜峰，Ⅲ為檢測帶的PSA光譜峰，Ⅳ為質(zhì)控帶的質(zhì)控物光譜峰。

2 系統(tǒng)操作使用方法

1)開機。2)插入IC卡。3)將加有待測樣品的量子點免疫層析試條放于試條槽中。4)鍵盤讀入檢測參數(shù)，包括IC卡上存貯的被檢物標準曲線和質(zhì)控帶光密度參考監(jiān)控值、系統(tǒng)自檢掃描時間、樣品名稱、樣品編號、試條批號、試條效期、檢測者姓名、檢測日期、IC卡密碼等。之后，系統(tǒng)自動開始自檢計時。5)系統(tǒng)自檢結(jié)束，系統(tǒng)自動開始樣品檢測。6)顯示檢測結(jié)果。

3 評價

3.1 量子點免疫層析

免疫層析是在酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)的基礎上發(fā)展起來的一種免疫標記技術。該技術簡單、快速，幾分鐘就能獲得檢測結(jié)果，被稱為“濃縮的ELISA”。目前的免疫層析技術主要采用膠體金標記試條進行樣品檢測[9-12]，不足之處是：該技術檢測樣品只能定性檢測，難以定量和多元指標檢測。量子點具有熒光發(fā)光亮度高、激發(fā)譜線寬、發(fā)射譜線窄、熒光壽命長、Stokes位移大等特點，不同粒徑、成分和結(jié)構(gòu)的量子點能產(chǎn)生不同特征波長反射熒光，且產(chǎn)生的特征波長反射熒光光譜不交疊[13-16]。選用不同粒徑、成分和結(jié)構(gòu)的量子點作為熒光標記物分別標記試條被檢物檢測相關分子，通過一個適當延遲時間檢測其發(fā)出的特征波長熒光強度，不僅能有效消除背景熒光干擾(如生物體自熒光干擾和分析用材料產(chǎn)生的本底熒光干擾等)，而且能準確實現(xiàn)樣品多元指標同時快速定量檢測。目前，量子點免疫層析試條用于生物醫(yī)學樣品檢測已見專利文獻報道[17-19]，但基于量子點免疫層析試條的定量檢測儀器未見報道，本文工作屬于先例。

3.2 系統(tǒng)工作機制

量子點標記物在試條上虹吸滲移產(chǎn)生反射熒光的過程屬于動態(tài)反應過程。不同量子點試條或不同批次試條，由于制備工藝和原材料選用等差異，其產(chǎn)品質(zhì)量不會完全相同，勢必影響被檢物濃度的精確測定。例如，制備試條所用的纖維素膜來源不同、膜濾孔大小不同、試條厚度不同等有可能使反應物在試條上以不同的虹吸滲移速率前行，有的反應物甚至可能被滯留在試條檢測帶和質(zhì)控帶之前的試條滲移途中[20]。此外，檢測樣品時所處環(huán)境條件不可能完全一致，也有可能影響到試條反應物在試條上的滲移速率，從而影響到被檢物濃度的精確測定。本系統(tǒng)采用量子點層析試條隨配IC卡存貯被檢物相應標準曲線以定量檢測被檢物、并由IC卡同時提供試條質(zhì)控帶光密度參考監(jiān)控值以提示反應成敗，能較好地解決上述問題。IC卡即插即用，存貯的被檢物標準曲線和試條質(zhì)控帶光密度參考監(jiān)控值可隨試條批間差異適時靈活校準，操作不僅簡便，而且提高了檢測的精確性和靈活性。樣品檢測時，IC 卡存貯的試條質(zhì)控帶光密度參考監(jiān)控值會提示試條反應過程是否成立、檢測結(jié)果是否真實有效(試條反應失敗時，檢測過程得到的OD質(zhì)控帶值與IC卡上存貯的相應OD質(zhì)控帶值會產(chǎn)生極大統(tǒng)計學誤差)。IC 卡還可作臨時存儲器存貯儲檢測結(jié)果，并可打印、保存和移攜。

3.3 系統(tǒng)應用

本系統(tǒng)應用廣泛，系統(tǒng)硬件可持續(xù)共用。不同待檢樣品檢測時，僅需更換相應量子點免疫層析試條和相應IC卡即可實現(xiàn)樣品多指標定量檢測。試條為一次性使用品，IC卡為同批次試條配套品。待檢樣品可以是來自臨床或非臨床的血液(包括全血、血清、血漿)、體液、尿液、唾液、生殖道分泌物或其他液態(tài)樣品或粘稠狀樣品。

4 結(jié)語

本文介紹了一種基于CCD的量子點免疫層析試條的樣品定量檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)不需要其他儀器設備、試劑以及復雜的操作就能快速準確定量檢測生物醫(yī)學樣品多指標，具有檢測快速、靈敏度高、結(jié)果客觀、操作簡單、使用靈活等優(yōu)點，在生物醫(yī)學樣品檢測方面具有廣闊應用前景。本系統(tǒng)已申請獲得國家專利[21]。

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DesignofaQuantitativeSystemforQuantumDotImmunochromatographyStrip

MAYicai*，HOUFei，WANGChunying

(School of Life Science and Technology, University of Electronic Science and Technology, Chengdu 610054, China)

A novel quantitative system for quantum dot immunochromatography strip was designed. It is composed of quantum dot immunochromatography strip, strip rack, scanning system, charge coupled device (CCD), signal amplifier, analog/digital converter(A/D), micro chip unit (MCU), display device, printer, keyboard and an IC card used together with the strip. The MCU controls the movement of the strip rack after reading the parameters of the IC card, making the optical fiber probes of the scanning system automatically scan the strip. The collected characteristic reflection fluorescence is transmitted to the MCU for optical signal identification and concentration calculation through the CCD, the signal amplifier and the analog/digital converter. The display device shows test results. This new system can implement multi-component quantitative detections for sample. It has the characteristic of rapid detection, high sensitivity, objective results and flexible use, thus having a broad prospect for application in biological medicine.

quantum dot(QD); quantitative system; immunochromatography strip; charge coupled device (CCD)；design

2013-10-30

四川省科技支撐計劃“乙肝兩對半快速檢測筆研制”(2010SZ0061)；成都市科技攻關計劃“筆式血液傳染病快速聯(lián)檢試劑盒研制”(10GGYB080SF-023)

馬義才(1956- )，男(漢族)，四川宜賓人，副教授，碩士，研究方向：分子標記與檢測，通信作者郵箱：scmyc@uestc.edu.cn。

侯飛(1985- )，男(漢族)，湖北人，在讀碩士研究生，研究方向：分子標記與檢測。

TH77

A

2095-5383(2013)04-0010-04