劉建武，萬(wàn)家川，李良剛

(成都體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)系，成都 610041)

高碳水化合物條件下鼠肌GLUT4表達(dá)與CaMK/HDAC5關(guān)系的研究

劉建武，萬(wàn)家川，李良剛*

(成都體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)系，成都 610041)

觀察Caffeine誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞GLUT4表達(dá)的潛在分子調(diào)控機(jī)制是否是Caffeine-Ca2+-CaMKⅡ-HDAC5信號(hào)通路。8周齡雄性Wistar大鼠42只，隨機(jī)分為高碳Caffeine組(HGC)、高碳KN62組(HGK)、低碳Caffeine組(LGC)和低碳KN62組(LGK)，每組12只。分別給予不同飲食加Caffeine或KN62刺激。檢測(cè)CaMKⅡ(Thr286)位點(diǎn)、HDAC5(Ser498)位點(diǎn)和HDAC5(Ser259)位點(diǎn)磷酸化水平以及GLUT4蛋白表達(dá)水平。與HGC組相比LGC組GLUT4蛋白表達(dá)、CaMKⅡ(Thr286) 、HDAC5(Ser498)HDAC5(Ser259)磷酸化水平都顯著增加性高于HGC組和LGK組。無(wú)論是在低碳還是在高碳濃度下骨骼肌細(xì)胞GLUT4蛋白表達(dá)變化都對(duì)應(yīng)著上游CaMKⅡ蛋白位點(diǎn)(Thr286)磷酸化水平和下游HDAC5蛋白位點(diǎn)(Ser498)和(Ser259)磷酸化的變化，所以CaMKⅡ調(diào)節(jié)GLUT4表達(dá)的機(jī)制至少涉及到CaMKⅡ征用轉(zhuǎn)錄抑制子HDAC5。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4；鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶；組蛋白去乙?；?

糖尿病目前被認(rèn)為是威脅人類健康的重大疾病之一。胰島素抵抗(IR)是糖尿病發(fā)病的重要機(jī)制，特別是Ⅱ型糖尿病。胰島素抵抗的關(guān)鍵影響部位在骨骼肌。葡萄糖是一個(gè)極性分子，不能自由地穿梭細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，需要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glucose Transporter, GLUT)的轉(zhuǎn)運(yùn)才能進(jìn)入細(xì)胞，所以葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)蛋白表達(dá)水平在很大程度上限制了骨骼肌攝取葡萄糖的速率，骨骼肌內(nèi)僅因過(guò)量表達(dá)GLUT4就能夠全面改善和逆轉(zhuǎn)糖尿病鼠胰島素抵抗的各項(xiàng)癥狀。因此研究GLUT4蛋白表達(dá)機(jī)制具有重要意義。高碳濃度會(huì)減弱骨骼肌細(xì)胞內(nèi)GLUT4的表達(dá)，而低碳能加強(qiáng)它的表達(dá)。利用此特征我們通過(guò)高碳飲食誘導(dǎo)Wistar大鼠骨骼肌形成胰島素抵抗模型，而低碳和禁食能夠獲得Wistar大鼠骨骼肌形成胰島素敏感模型。并給予Ca2+特殊激動(dòng)劑Caffeine和CaMK特殊抑制劑KN62刺激，觀察在高/低碳濃度下骨骼肌細(xì)胞內(nèi)GLUT4的表達(dá)變化是否發(fā)生骨骼肌細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡ(Thr286)位點(diǎn)、HDAC5(Ser498)和HDAC5(Ser259)位點(diǎn)磷酸化水平的對(duì)應(yīng)變化。進(jìn)一步探討和GLUT4表達(dá)可能分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型表觀遺傳學(xué)分子靶點(diǎn)藥物以及提高運(yùn)動(dòng)能力提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠48只，8周齡，體重(180±24.2) g，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。標(biāo)準(zhǔn)嚙齒目動(dòng)物分籠喂養(yǎng)，鼠糧由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物服務(wù)站提供。保證通風(fēng)條件良好，室溫控制在28～31 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，自然光照。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和器材

GLUT4抗體購(gòu)于 Abcam、HDAC5(Ser498)和HDAC5(Ser259)抗體購(gòu)于北京博奧森，CAMKⅡ(Thr286)抗體購(gòu)于宜百康生物科技股份有限公司，辣根標(biāo)記羊抗鼠和羊抗兔IgG、GADPH購(gòu)于北京中杉，化學(xué)顯色劑購(gòu)于Santa cruz biotechnology，Caffeine 購(gòu)于 Enzo Life Sciences，DMSO 購(gòu)于Sigma，KN62 購(gòu)于 Cayman Chemical，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce公司，磷酸化蛋白、全蛋白提取試劑盒由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供。

1.3 研究方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)期間均給予普通標(biāo)準(zhǔn)鼠糧和蒸餾數(shù)，適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機(jī)分為高碳Caffeine組(HGC)、高碳KN62組(HGK)、低碳Caffeine組(LGC)和低碳KN62組(LGK)，每組12只。飲食干預(yù)前為排除大鼠體內(nèi)本身糖原干擾，所有大鼠均給予一次5%負(fù)荷的負(fù)重力竭游泳刺激。負(fù)重力竭游泳刺激后高碳組均給予高碳食物和5%蔗糖水飲用水，72 h后高碳KN62組腹腔注射KN62(0.1 mg/kg，濃度為10 μmol/L，溶解于DMSO)，KN62刺激30 min后再次腹腔注射Caffeine(5 mg/kg，4 mmol/L，溶解于DMSO)Caffeine刺激后分2 min、24 h 2個(gè)時(shí)間段斷頸處死提取腓腸肌組織樣本；高碳Caffeine組直接腹腔注射Caffeine，Caffeine刺激后分2 min、24 h 2個(gè)時(shí)間段斷頸處死提取腓腸肌組織樣本；低碳組負(fù)重力竭游泳刺激后給予低碳食物和蒸餾水48 h加禁止食24 h，低碳Caffeine組同樣給予Caffeine刺激，低碳KN62組Caffeine刺激前30 min腹腔注射KN62，Caffeine刺激后分2 min、24 h 2個(gè)時(shí)間段各斷頸處死6只提取腓腸肌組織樣本。

1.3.2 蛋白提取與測(cè)定

磷酸化蛋白和全蛋白提取按照南京凱基生物科技發(fā)展有限公司的磷酸化蛋白和全蛋白提取試劑盒說(shuō)明提取。磷酸化蛋白和全蛋白濃度均采用BCA法測(cè)定。

1.3.3 蛋白表達(dá)與磷酸化水平測(cè)定

采用western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)。首先對(duì)蛋白樣品進(jìn)行變性處理。將蛋白樣品和5*loading buffer 4∶1混勻，震蕩，然后沸水中煮沸5～10 min即可完成變性處理。根據(jù)BCA測(cè)定的蛋白濃度，提前計(jì)算好上樣量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Bio-rad image lab圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

Compare to HGC，★：plt;0.05★★:plt;0.01；Compare to lGC，▲：plt;0.05▲▲：plt;0.01；Compare to HGk，※：plt;0.05※※：plt;0.01；Compare to lGk，■：plt;0.05■■：plt;0.01圖1 GLUT4在各實(shí)驗(yàn)刺激下的蛋白表達(dá)

1.3.4 數(shù)理統(tǒng)計(jì)法

2 結(jié)果

2.1 GLUT4在各實(shí)驗(yàn)刺激下的蛋白表達(dá)

如圖1所示，低碳Caffeine組較各組均存在顯著性差異，證明低碳和Caffeine均可上調(diào)GLUT4的表達(dá)，而且兩者效果上存在一定疊加。高碳Caffeine組(HGC)GLUT4蛋白表達(dá)水平顯著性低于低碳Caffeine組(LGC)plt;0.01，較高碳KN62組(HGK)pgt;0.05無(wú)明顯差異。表明高碳確實(shí)可延遲GLUT4的表達(dá)，其效果甚至可掩蓋Caffeine對(duì)GLUT4表達(dá)的促進(jìn)作用。高碳KN62組(HGK)GLUT4蛋白表達(dá)水平低于高碳Caffeine組(HGC)，雖無(wú)顯著性差異pgt;0.05；低碳KN62組(LGK)顯著性低于低碳Caffeine組(LGC)plt;0.01。表明提前給予KN62刺激可下調(diào)GLUT4的表達(dá)。

2.2 CaMKⅡ(Thr286)在各實(shí)驗(yàn)刺激下蛋白表達(dá)

Compare to HGC，★：plt;0.05★★:plt;0.01；Compare to lGC，▲：plt;0.05▲▲：plt;0.01；Compare to HGk，※：plt;0.05※※：plt;0.01；Compare to lGk，■：plt;0.05■■：plt;0.01圖2 CaMKⅡ(Thr286)在各實(shí)驗(yàn)刺激下蛋白表達(dá)

Compare to HGC，★：plt;0.05★★:plt;0.01；Compare to lGC，▲：plt;0.05▲▲：plt;0.01；Compare to HGk，※：plt;0.05※※：plt;0.01；Compare to lGk，■：plt;0.05■■：plt;0.01圖3 HDAC5(Ser498)在各實(shí)驗(yàn)刺激下蛋白表達(dá)

Compare to HGC，★：plt;0.05★★:plt;0.01；Compare to lGC，▲：plt;0.05▲▲：plt;0.01；Compare to HGk，※：plt;0.05※※：plt;0.01；Compare to lGk，■：plt;0.05■■：plt;0.01圖4 HDAC5(Ser259)在各實(shí)驗(yàn)刺激下蛋白表達(dá)

如圖2所示，低碳Caffeine組(LGC)較高碳Caffeine組(HGC)CaMKⅡ(Thr286)磷酸化水平上調(diào)2.62倍。低碳KN62組CaMKⅡ(Thr286)磷酸化水平是高碳Caffeine組(HGC)2.35倍。預(yù)示著高碳顯著性抑制CaMKⅡ(Thr286)的磷酸化。低碳Caffeine組(LGC)較低碳KN62組上調(diào)0.536倍。高碳Caffeine組(HGC)和高碳KN62(HGK)CaMKⅡ(Thr286)磷酸化水平幾乎相同，兩者無(wú)顯著性差異。表明低碳環(huán)境下Caffeine可激活CaMKⅡ(Thr286)，而提前給予KN62刺激減緩或抵消Caffeine對(duì)CaMKⅡ(Thr286)影響，高碳刺激同樣可達(dá)到這種效果。另外數(shù)據(jù)顯示，低碳Caffeine組(LGC)顯著性高于高碳KN62組(HGK)，其CaMKⅡ(Thr286)磷酸化水平是高碳KN62(HGK)的4.15倍。低碳KN62組(HGK)是高碳KN62(HGK)的2.70倍。說(shuō)明Caffeine和低碳可共同影響CaMKⅡ(Thr286)磷酸化。

2.3 各組HDAC5(Ser498)和(Ser259)磷酸化水平

如圖3和圖4所示，高碳Caffeine組(HGC)的HDAC5(Ser498)和(Ser259)磷酸化水平顯著性高于高碳KN62組(HGK)，低碳Caffeine組顯著性高于低碳KN62組，p值均小于0.01，表明Caffeine刺激下HDAC5(Ser498)和(Ser259)被激活，而KN62減弱這一效果。而高碳Caffeine組(HGC)顯著性低于無(wú)論低碳Caffeine組顯還是低碳KN62組，p值均小于0.01。意味著高碳可很大程度上抑制HDAC5(Ser498)的磷酸化，相反低碳則在一定程度上上調(diào)HDAC5(Ser498)和(Ser259)的磷酸化水平。另外低碳Caffeine組的HDAC5(Ser498)和(Ser259)磷酸化水平也顯著高于高碳KN62組(HGK)plt;0.01，說(shuō)明Caffeine可聯(lián)合低碳共同調(diào)節(jié)HDAC5(Ser498)和(Ser259)磷酸化。低碳Caffeine組(LGC)顯著性高于其他各組plt;0.01，表明Caffeine和低碳刺激可共同上調(diào)HDAC5(Ser498)和(Ser259)磷酸化水蛋白表達(dá)。

3 討論

3.1 Caffeine和KN62對(duì)CaMKⅡ影響

Ca2+對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)是通過(guò)Ca2+與鈣結(jié)合蛋白的作用而發(fā)揮不同的生理功能。鈣結(jié)合蛋白有2類：一類是真正的Ca2+受體蛋白，這種蛋白本身無(wú)活性，如鈣調(diào)素(CaM)；另一類為鈣調(diào)節(jié)酶如PKC，α酮戊二酸脫氫酶，磷脂酶C，磷脂酶A2等。鈣調(diào)素(CaM)細(xì)胞內(nèi)主要Ca2+的受體蛋白，Ca2+的許多功能都是通過(guò)CaM完成的。靜息細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度約為0.1 μmol/L，當(dāng)細(xì)胞受到刺激或神經(jīng)沖動(dòng)后，細(xì)胞膜Ca2+通道開(kāi)放，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)貯存的Ca2+釋放出來(lái)，胞漿Ca2+濃度上升， 當(dāng)濃度增加到1 μmol/L以上時(shí)，Ca2+就會(huì)與CaM結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合物。Ca2+-CaM復(fù)合物可激活很多酶，其中就包括CaMKⅡ。Caffeine刺激可以引起肌肉細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，其深層機(jī)制很可能與L型電壓門控鈣離子通道有關(guān)。運(yùn)動(dòng)刺激同樣可以引起肌肉細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，而且有大量報(bào)道顯示運(yùn)動(dòng)/肌肉收縮可上調(diào)CaMKⅡ(Thr286)的磷酸化表達(dá)。因此Caffeine也可通過(guò)Ca2+-CaM復(fù)合物激活CaMKⅡ。KN62全名1-[N,O-二(5-異喹啉磺?；?-N-甲基-L-型酪氨酸]-4-苯基哌嗪，作用是CaMKⅡ特異性抑制劑。KN62可與CaM結(jié)合位點(diǎn)相互作用，阻礙CaM與CaMKⅡ的結(jié)合，進(jìn)而抑制CaMKⅡ的磷酸化。因?yàn)镵N62不能直接作用于CaMKⅡ，所以它不能抑制已經(jīng)磷酸化的CaMKⅡ的活性而只能抑制未被激活的CaMKⅡ。本研究低碳組的結(jié)果表明：Caffeine可上調(diào)CaMKⅡ(Thr286)的磷酸化水平，而提前運(yùn)用CaMKⅡ特殊抑制劑KN62可減緩或抵消這種效果。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與其他文獻(xiàn)的結(jié)果一致，表明由Caffeine引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高能夠有效地激活CaMKⅡ蛋白激酶。

3.2 CaMKⅡ是否參與高和低碳水化合物影響的GLUT4蛋白表達(dá)

CaMKⅡ目前已被證實(shí)參與GLUT4蛋白表達(dá)調(diào)控，但是這些研究主要集中在CaMKⅡ的抑制劑和激動(dòng)劑方面。有關(guān)高碳和低碳對(duì)CaMKⅡ的影響的直接證據(jù)較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示高碳Caffeine組(HGC)的CaMKⅡ(Thr286)磷酸化水平顯著低于低碳Caffeine組(LGC)(plt;0.01)。而且高碳Caffeine組(HGC)與高碳KN62組(HGK)無(wú)顯著差異pgt;0.05, 高碳CaMKⅡ(Thr286)蛋白表達(dá)的抑制效果甚至可掩蓋或抵消Caffeine對(duì)CaMKⅡ磷酸化的影響。也就是說(shuō)高碳對(duì)GLUT4表達(dá)的延遲影響很可能是通過(guò)對(duì)CaMKⅡ的抑制作用引起的。

在本研究中LGC CaMKⅡ(Thr286)磷酸化水平顯著高于其他各組，證明了CaMKⅡ確實(shí)參與了低碳影響的GLUT4蛋白表達(dá)。但低碳KN62組(LGK)顯著低于低碳Caffeine組(LGC)，表明KN62可抑制CaMKⅡ(Thr286)的磷酸化水平。

3.3 CaMKⅡ的變化是否引起HDAC5的變化

組蛋白的乙?；腿ヒ阴；腔虮磉_(dá)的中樞調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)：基礎(chǔ)狀態(tài)下組蛋白的去乙?；癄顟B(tài)主要由HDAC5 蛋白維持。HDAC5的去乙?；墒菇M蛋白賴氨酸殘基側(cè)鏈帶上正電荷，而DNA主鏈本身帶負(fù)電荷，因此HDAC5的去乙?；饔每墒菇M蛋白和DNA主鏈緊密結(jié)合，阻礙轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而抑制了靶基因的轉(zhuǎn)錄。而HDAC5 與14-3-3 蛋白伴侶結(jié)合后的轉(zhuǎn)移出核，相反可解除對(duì)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄活性抑制。所以提高HDAC5的岀核速率就可加速基因表達(dá)。離體研究[6]結(jié)果表明：HDAC5 的出核速率高度正相關(guān)于HDAC5的磷酸化水平，特別是HDAC5(Ser259)和HDAC5(Ser498) 2個(gè)位點(diǎn)的磷酸化。那么CaMK能否磷酸化HDAC5？在神經(jīng)元研究中發(fā)現(xiàn)，IIa類HDACs的HDAC4和HDAC5的岀核活動(dòng)依賴于CaMK蛋白活動(dòng)。

本研究發(fā)現(xiàn)HDAC5(Ser259 )和HDAC5(Ser498)的磷酸化水平與CaMKⅡ(Thr286)的磷酸化水平存在高度的相關(guān)關(guān)系。CaMKⅡ(Thr286)表達(dá)相對(duì)較高的組，其HDAC5(Ser498)和HDAC5(Ser259)的表達(dá)也相對(duì)較高；而CaMKⅡ(Thr286)表達(dá)相對(duì)較低的組，HDAC5(Ser498)和HDAC5(Ser259)也呈現(xiàn)較低水平。在低碳組，Caffeine刺激不僅能使低濃度葡萄糖組骨骼肌細(xì)胞內(nèi)CAMKⅡ的Thr 286位點(diǎn)磷酸化水平增加1.26倍，還能夠使低濃度葡萄糖組骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的HDAC5蛋白的Ser498位點(diǎn)與Ser259位點(diǎn)磷酸化水平增加1.06倍和1.25倍；另一方面，高濃度葡萄糖確實(shí)際能夠抑制由Caffeine刺激引起的CAMKⅡ磷酸化，同時(shí)也能夠抑制由Caffeine引起的HDAC5蛋白Ser498位點(diǎn)與Ser259位點(diǎn)磷酸化水平增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)CAMKⅡ蛋白與HDAC5蛋白關(guān)系密切，這提示在由Caffeine引起的細(xì)胞信號(hào)事件中HDAC5可能是CAMKⅡ信號(hào)途徑中的一個(gè)關(guān)鍵性蛋白[2]。

3.4 CaMKⅡ及HDAC5的變化是否引起骨骼肌細(xì)胞GLUT4表達(dá)變化

GLUT4轉(zhuǎn)錄基因的開(kāi)放受控于GLUT4基因啟動(dòng)子上游順式作用元件與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)多個(gè)物種的GLUT4基因啟動(dòng)子都存在2個(gè)保守序列，MEF2結(jié)合位點(diǎn)(位于啟動(dòng)子上游順式作用元件-464至-473區(qū)域)和GEF結(jié)合位點(diǎn)(啟動(dòng)子上游順式作用元件-712至-742區(qū)域)。MEF2綁定結(jié)合在GLUT4基因啟動(dòng)子順式作用元件上并可募集抑制性結(jié)合蛋白，通過(guò)抑制性結(jié)合蛋白抑制GLUT4基因的表達(dá)。

HDAC5因其對(duì)組蛋白的去乙?；饔?，抑制了很多基因的轉(zhuǎn)錄。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的GLUT4基因和蛋白表達(dá)伴有組蛋白的乙?；?，表明HDAC 5很可能就是MEF2調(diào)控GLUT4基因表達(dá)所募集的抑制性蛋白。Han等[3]發(fā)現(xiàn)MEF2可與HDAC5結(jié)合，并在HDAC5找到了MEF2的結(jié)構(gòu)域，證明了GLUT4的基因表達(dá)調(diào)控很可能是通過(guò)MEF2綁定結(jié)合在GLUT4基因啟動(dòng)子順式作用元件上并可募集HDAC5實(shí)現(xiàn)的。因此HDAC5在細(xì)胞核內(nèi)的濃度對(duì)GLUT4基因表達(dá)至關(guān)重要。增加HDAC5在細(xì)胞核內(nèi)的濃度就會(huì)抑制GLUT4基因的表達(dá)；研究[4]報(bào)道骨骼肌細(xì)胞中敲出HDAC5就能夠增加GLUT4的表達(dá)和葡萄糖攝取。McGee等[5]細(xì)胞離體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：加入野生型HDAC5表達(dá)質(zhì)粒增加HDAC5的表達(dá)就能夠很大程度抑制GLUT4基因的表達(dá)。而增加HDAC5磷酸化水平促進(jìn)HDAC5的岀核，減少HDAC5細(xì)胞核內(nèi)的濃度就會(huì)可上調(diào)GLUT4基因和蛋白的表達(dá)。本研究中中HDAC5磷酸化水平相對(duì)較高的組，其GLUT4蛋白的表達(dá)也相對(duì)較高，也證實(shí)了這一點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

Caffeine能夠顯著引起骨骼肌細(xì)胞GLUT4蛋白表達(dá)，且Caffeine組的CaMKⅡ(Thr286)的磷酸化水平與HDAC5(Ser498)和HDAC5(Ser259)磷酸化水平是完全成正相關(guān)關(guān)系；而抑制劑KN62組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示KN62能夠顯著抑制CaMKⅡ(Thr286) 磷酸化，這一磷酸化改變就同時(shí)伴有HDAC5(Ser498)和(Ser259)位點(diǎn)磷酸化水平與GLUT4表達(dá)水平顯著降低的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果從正反兩個(gè)方向上證實(shí)了運(yùn)動(dòng)模擬信號(hào)Caffeine，即Ca2+信號(hào)能引起的骨骼肌細(xì)胞GLUT4的表達(dá)可能是通過(guò)Caffeine-Ca2+-CaMKⅡ-HDAC5信號(hào)通路機(jī)制。

[1] GUO L,STRIPAY J L,ZHANG X,et al,CaMKIα regulates AMP Kinase-Dependent, TORC-1-Independent autophagy during lipopolysaccharide-induced acute lung neutrophilic inflammation[J].J Immunol,2013,190(7):3 620-3 628.

[2] 李良剛.Ⅱ型組蛋白去乙?；缚赡軈⑴c收縮骨骼肌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[J].中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2007(6):763-766，743.

[3] HAN A,PAN F,JANES C,et al.Sequence-specific recruitment of transcriptional co-repressor cabin 1 by myocyte enhancer factor-2[J].Nature,2003,422:730.

[4] 李良剛,陳槐卿.CaMK和AMPK信號(hào)通路能共調(diào)收縮信號(hào)誘導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞GLUT4基因轉(zhuǎn)錄[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2009(4):471-479.

[5] MCGEE S L,VANDENDEREN B J,HOWLETT K F,et al.AMP-activated protein kinase regulates GLUT4 transcription by phosphorylating histone deacetylase 5[J].J Diabetes,2008，57(4):860-867.

RelationshipbetweenGLUT4ExpressionandCaMK/HDAC5inRatSkeletalMuscleunderDifferentCarbohydrates

LIUJianwu,WANJiachuan,LILianggang*

(Department of Sports Medicine, Chengdu Sport University, Chengdu 610041，China)

To find out whether the effect of Caffeine on regulating the GLUT4 expression was related with Caffeine-Ca2+- CaMKⅡ-HDAC5 signal pathway. 48 male Wistar rats which were 8-week-old were randomly divided into four groups (n=12), named as HGC group, HGK group, LGC group and LGK group. The rats were fed with different diet and induced by Caffeine or KN62. And CaMKⅡ(Thr286)、HDAC5(Ser498) and HDAC5(Ser259)phosphorylation and GLUT4 protein expression were tested by western blotting. Compared with the LGK group, both CaMKⅡ(Thr286) and HDAC5(Ser259) and HDAC5(Ser498)phosphorylation increased significantly in skeletal muscle cells in LGC group. Compared with the LGK and LGC group, CaMKⅡ(Thr286)、HDAC5(Ser498) and HDAC5(Ser259)phosphorylation decreased obviously in HGC and HGK group. Meanwhile, the changes of CaMKⅡ(Thr286)、HDAC5(Ser498) and HDAC5(Ser259)phosphorylation in HGC group had no significant difference with that in HGK group. Therefore (1) Caffeine could remarkably increase the expression of GLUT4, and increase the CaMKⅡ(Thr286)、HDAC5(Ser498) and HDAC5(Ser259)phosphorylation and exist a remarkably positive correlation. While KN62 could significantly decrease the CaMKⅡ(Thr286)、HDAC5(Ser498) and HDAC5(Ser259)phosphorylation and the expression GLUT4. They demonstrated that the effect of Ca2+signal which was induced by Caffeine on increasing the expression of GLUT4 was possibly related with Caffeine-Ca2+- CaMKⅡ-HDAC5 signal pathway. (2) Whatever the rats were fed with, the expression of GLUT4 was corresponded with CaMKⅡ(Thr286)、HDAC5(Ser498) and HDAC5(Ser259) in skeletal muscle cells. So the effect of CaMKⅡon regulating the expression of GLUT4 in skeletal muscle was related with inducing HDAC5 and regulating its (Ser 498) site and(Ser 259)site.

GLUT4;CaMK;HDAC5

2013-11-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“CaMK通過(guò)HDAC5轉(zhuǎn)錄運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)性骨骼肌細(xì)胞GLUT4基因的調(diào)控機(jī)制研究”(30971417/C140501)

劉建武(1988- )，男(漢族)，山東臨沂人，在讀碩士研究生，研究方向：運(yùn)動(dòng)體能、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)及細(xì)胞能量代謝基因與蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究。

李良剛(1960- )，男(漢族)，四川成都人，教授，博士，研究方向：運(yùn)動(dòng)體能、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)及細(xì)胞能量代謝基因與蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究，通信作者郵箱：554905620@qq.com。

R587.1

A

2095-5383(2013)04-0005-05