董鶴娟，丁 軻*，恒子鈐，賈艷艷，彭春平，羅偉光，李 旺

(1.河南省動物疫病與公共安全院士工作站，河南 洛陽 471003；2.河南科技大學 宏翔發(fā)酵飼料實驗室，河南 洛陽 471003;3.河南省高等學校環(huán)境與畜產品安全重點學科開放實驗室，河南 洛陽 471003)

我國是糧食大國，纖維素資源極為豐富，每年僅農作物秸稈產量就高達7×108t，約占世界20%[1-2]。但秸桿中纖維素較難降解，所以目前秸桿僅有極少部分用于反芻動物飼料，絕大多數(shù)都被燃燒，不僅造成了資源的浪費，而：還會帶來環(huán)境污染[3-4]。將秸桿中的纖維素降解成畜禽可利用的多糖、蛋白質或其他營養(yǎng)成分的研究，已成為當務之急。目前最可能利用的手段就是篩選高效纖維素酶分解菌，但秸桿纖維素的降解不是單一菌種能夠解決的，因為秸桿的降解需要β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等多種纖維素酶共同參與才能完成[4]。已有的研究主要集中在真菌方面，如里氏木霉、綠色木霉、白腐菌、米曲霉等[5-7]，對細菌方面研究的較少。但真菌存在活性不穩(wěn)定和生物安全隱患等問題，而芽孢桿菌具有產酶能力強，耐高溫、強酸，環(huán)境適應能力強等特點，所以很適宜作為秸桿發(fā)酵用菌種。本研究擬從自然界中分離篩選高產纖維素酶的芽孢桿菌，為研究秸桿的生物降解提供了基礎材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 品 分別取自河南省洛陽、商丘、周口、漯河等8個地市周圍的秸桿、稻草垛下層5～10 cm的土壤58份。

1.1.2 培養(yǎng)基 (1)羧甲基纖維素鈉(CMC)剛果紅分離培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.5%，CMC 1%，調pH 7.0～7.2，121 ℃，高壓滅菌20 min，每100 mL培養(yǎng)基加入3 mL 0.5%剛果紅;(2) 種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，調pH 7.0～7.2；(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，CMC 1%，調pH 7.0～7.2。

1.1.3 主要試劑的配制 3，5-二硝基水楊酸試劑配制：稱取200 g酒石酸鉀鈉，溶于一定量水中，加熱溶解，添加3,5-二硝基水楊酸10.0 g、氫氧化鈉10.0 g，溶解后加入苯酚2.0 g、無水亞硫酸鈉0.5 g，全部加熱溶解后，冷卻至室溫，定容至1 000 mL。用前一周配制。

1.2 方 法

1.2.1 樣品的處理 取適量的樣品于試管中，分別加入5 mL pH 3.0的滅菌生理鹽水，混勻，置80 ℃水浴20 min，再靜止放置20 min，吸取上清200 μL涂于CMC-剛果紅分離培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結果。

1.2.2 產纖維素酶菌株的篩選與純化 根據(jù)菌落周圍酶解圈直徑和菌落直徑比值大小，由分離培養(yǎng)基上挑選產纖維素酶和酶活較高的菌株連續(xù)3次劃線接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，置4 ℃冰箱放置24 h，采用革蘭氏染色法篩選能夠產生芽孢的桿菌。

1.2.3 復篩 取上述篩選的菌株的新鮮菌液2 μL滴種于CMC-剛果紅培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，測量透明圈直徑(H)和菌落直徑(C)，選擇二者比值(H/C)較大的菌株進一步進行酶活測定。

1.2.4 纖維素酶酶活測定 葡萄糖標準曲線繪制，方法參考國標法(GB/T 23881-2009)。取培養(yǎng)36 h的菌液，6000 r/min離心10 min，取上清1 mL，加入1 mL含1% CMC的pH 4.8醋酸-醋酸鈉緩沖液，混勻，50 ℃恒溫水浴30 min，加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后定容到25 mL，在520 nm下比色，測出吸光度值，查閱標準曲線后，求出溶液中的葡萄糖含量。酶活力單位規(guī)定：在pH 5.0、50 ℃條件下，以1 mL纖維素酶液在1 min內水解羧甲基纖維素鈉生成1 μmoL葡萄糖的酶量為1個單位(U)。

1.2.5 菌種的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)學鑒定 將上述篩選的菌種在37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，采用革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.5.2 生理生化鑒定 菌株的生理生化鑒定參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]。

1.2.5.3 菌種16S rDNA分子鑒定 根據(jù)芽胞桿菌的16S rDNA序列模板設計一對引物，P1:5'-CTGCAGCTACCGGTCGCCACCATG-3'，P2:5'-GAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'。按照基因組抽提試劑盒(北京方寶生物有限公司)抽提的芽孢桿菌基因組為模板，PCR反應體系如下：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(10 mM) 1 μL，

MgCl22 μL，上下游引物(10 mM)各1 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 1 μL，模板DNA 1 μL，超純水 36 μL。反應參數(shù)：94℃，3 min→(94 ℃，50 s→55 ℃，45 s→72 ℃，90 s，30 循環(huán))→72 ℃，10 min→4 ℃，保存。將產物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳，并送至上海生物工程技術服務有限公司測序。將測序結果提交到GenBank中進行BLAST比對，選取相似性較高的序列，利用DNAstar7.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 菌株的初篩結果

將樣品經(jīng)酸和熱處理后，在分離培養(yǎng)基上初步分離出具有纖維素酶酶活的菌株42株，將這些菌株純化后分別滴種在CMC-剛果紅培養(yǎng)基上，通過比較酶解圈直徑H與菌落直徑C的比值大小(見圖1)，初步篩選出產纖維素酶較高的的菌株10株，結果見表1。由表1可知，所篩選出菌株的酶解圈與菌落直徑比在1.33～3.71，其中B.LY02最大。

圖1 部分菌株酶活平板篩選圖Fig. 1 Strains producing cellulase by Congo red medium

2.2 菌株的復篩結果

由表2可見，B.LY02酶活最高，可達0.5351 U/mL。因此，篩選出該菌株進行鑒定和后期研究。

2.3 菌株的形態(tài)學鑒定

在普通肉湯平板上37 ℃培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)菌落呈圓形，白色，表面濕潤，有光澤，邊緣整齊，單生或呈鏈狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色陽性，有芽孢，且呈橢圓形，近中生(圖2)。屬于典型的芽孢桿菌的特征(圖2C)。

表1 產纖維素酶菌株初篩結果Table 1 The screening results of cellulase-producing

注：H.酶解圈直徑;C.為菌落直徑。

Note: H.represents the diameter of hydrolysis circle;C.stands for the diameter of colonies.

表2 不同菌株纖維素酶的比活力測定結果Table 2 The results of cellulase specific activity of different strains U/mL

2.4 菌株的生理化性質鑒定

B.LY02生理生化結果見表3。由表3可見，接觸酶陽性，可還原硫化氫、硝酸鹽，可利用多種糖產酸，符合芽孢桿菌的典型特征。

圖2 部分菌株顯微形態(tài)圖Fig. 2 Microscopic morphology diagram of some strains

表3 B.LY02生理生化試驗結果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of Strain B.LY02

注：“-”代表陰性結果，“+”陽性結果。

Note:“-”represents negative result,“+”is for positive result.

2.5 菌株16S rDNA 分子鑒定結果

以菌株B.LY02基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增后在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，結果如圖3所示，在約1 500 bp處有一明亮的條帶，與預期大小一致。測序結果表明菌株B.LY02的16S rDNA序列長度為1 464 bp。

圖3 16S rDNA片段PCR擴增結果1.陰性對照；2，3.PCR產物；4.MarkerFig. 3 PCR results of 16S rDNA fragment of strain B.LY021.Nagtive control; 2，3.PCR product;4.Marker

2.6 基于16S rDNA序列及系統(tǒng)進化樹分析

將該序列提交到GenBank中進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)與地衣芽孢桿菌和球形芽孢桿菌兩個種成員具有較高的相似性，利用DNAstar7.0軟件包中Meglign中的Jotun Hein Method構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示，B.LY02與Bacillus licheniformis strain CICC10095(地衣芽孢桿菌)位于同一分支，同源性高達96.5%，親緣關系最近，因此，初步鑒定該菌屬于芽孢桿菌屬地衣芽孢桿菌種。

3 討 論

目前秸桿降解最有效的途徑應該還是生物降解[5-7]，而細菌，尤其是芽孢桿菌，是動物飼料中應用最為廣泛的一種益生菌，具有多種益生功能[9-10]。一般來說芽孢桿菌是細菌中產酶最多的菌種，而且酶活也較高[11-12]。本研究從自然界土壤中分離到了一株高產纖維素酶的芽孢桿菌，其新鮮培養(yǎng)液中酶的比活力最高可達0.5351 U/mL。嚴文岱等[1]分離的6株菌的纖維素酶比活力最高為0.2137 U/mL，郭成栓等[13]報道的短小芽孢桿菌的纖維素酶的比活力為1.96 U/mL。而段學輝等[15]從土壤中分離的綠色木霉CMC酶活力達146.68 U/mL，說明真菌分泌纖維素酶的能力強于細菌，所以可以根據(jù)實際需要，選擇不同的菌株進行纖維素的降解。本研究將對該菌株進行誘變和產酶條件優(yōu)化，進一步提高該菌株產纖維素酶的能力，我們將在以后的試驗中驗證其降解功效。

圖4 菌株B.LY02基于16S rDNA序列系統(tǒng)進化樹分析Fig. 4 The phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence of strain B.LY02

近年來關于產纖維素酶菌株分離的報道比較多[17-19]，但大多研究一般都是采用CMC作為底物，然后將樣品稀釋液涂布在分離培養(yǎng)基上，再采用剛果紅染色挑出產酶菌，這種方法要先影印出分離培養(yǎng)基上的菌落，程序繁瑣，工作量較大，且很難篩選到最優(yōu)菌株[20-22]。而用剛果紅染色的目的就是區(qū)分菌落周圍是否含有纖維素，與剛果紅和纖維素結合的時間沒有關系，兩者的結合是一種可逆反應。依據(jù)這個原理，本研究直接將過濾除菌的剛果紅溶液在倒平板前加入到培養(yǎng)基中，使其終濃度為1.5%左右(濃度控制在1.5%～2.0%最佳)，當培養(yǎng)基中的CMC被細菌降解時，剛果紅-纖維素復合物就會解離，從而在菌落周圍顯示出透明圈，可以更直觀、快捷、準確地進行產纖維素酶菌株的篩選。從該試驗的結果也可以看出，酶活測定的結果與透明圈和菌落直徑的比值呈一定的相關性，所以采用這種方法有利于篩選到高纖維素酶活的菌株。另外，試驗在對樣品初處理時采用了80 ℃高溫和pH 3.0處理，這對于有針對性地分離耐高溫和耐酸菌株的分離是很有效的，尤其是芽孢桿菌的分離，因為絕大多數(shù)細菌很難在80 ℃和pH 3.0條件下存活20 min，試驗結果也表明初分離的菌株絕大多數(shù)都是能夠產芽孢的菌株，說明這是一種排除其它雜菌分離特定菌株的最有效的方法之一。

4 結 論

本研究從土壤中分離獲得了一株高產纖維素酶的芽孢桿菌，經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌，而且該菌株具有耐熱和耐酸的性能。建立了一個簡便的產纖維素酶菌株的分離方法，為進一步從自然界中分離其它種類的產纖維素酶菌株提供了技術支持，為豐富益生菌菌種庫奠定了基礎。

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