栗穎華 ， 禹學(xué)禮 ，張德勛 ，陳君怡，許亞坤，李曉霞，昝林森

(1.河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003；2.洛陽(yáng)巨爾乳業(yè)有限公司，河南 洛陽(yáng)471031；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

GV期卵母細(xì)胞冷凍具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，GV期卵母細(xì)胞冷凍保存可以為放療癌癥患者、卵巢摘除患者保存生殖能力；在畜牧領(lǐng)域，未經(jīng)成熟培養(yǎng)的GV期卵母細(xì)胞現(xiàn)場(chǎng)冷凍可以避免長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸對(duì)卵母細(xì)胞造成的不良影響，為胚胎生物技術(shù)研究提供充足的試驗(yàn)材料。目前，卵母細(xì)胞的冷凍效率非常低，且大多以MII期卵母細(xì)胞為冷凍對(duì)象，牛MII期卵母細(xì)胞經(jīng)冷凍后再體外受精，囊胚率11%～25%[1]；而GV期卵母細(xì)胞對(duì)冷凍更敏感，一直被視為生物材料的“冷凍禁區(qū)”，直到近些年采用玻璃化冷凍才獲得成功，冷凍后成熟率僅為19%～21%，囊胚率僅為1%～5%[2]。影響牛GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效果的因素眾多，玻璃化冷凍液是最重要的影響因素之一。玻璃化冷凍液的特點(diǎn)是必須添加高濃度冷凍保護(hù)劑，冷凍中雖然高濃度冷凍保護(hù)劑可以降低冰晶的形成，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷[3]，但是也會(huì)因滲透壓的變化[4]及冷凍保護(hù)劑的化學(xué)毒性[5-6]而對(duì)細(xì)胞造成損傷。因此，不同冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞毒性、不同冷凍保護(hù)劑的配比是牛GV期卵母細(xì)胞冷凍的研究熱點(diǎn)之一。

本文擬在相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，探索不同玻璃化冷凍液對(duì)牛卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus oocyte complexes , COCs)冷凍后體外成熟及受精后發(fā)育能力的影響，從而檢測(cè)常用的幾種玻璃化冷凍液對(duì)卵母細(xì)胞的毒性，并篩選出最佳的牛GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍液。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 卵母細(xì)胞 從宰殺后的牛體內(nèi)取出卵巢，置于30 ℃的PBS中運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室；從直徑2～8 mm的卵泡中抽吸COCs，在體視顯微鏡下揀出，根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)隨機(jī)分組。精液為洛陽(yáng)白馬寺種公牛站生產(chǎn)的細(xì)管冷凍精液。

1.1.2 開(kāi)放式拉長(zhǎng)細(xì)管(open pulled straw, OPS)制備 在小酒精燈火焰上方加熱0.25 mL細(xì)管(IMV，L'Aigle，F(xiàn)rance)，細(xì)管變軟后拉伸至內(nèi)徑約0.8 mm，消毒備用。

1.1.3 主要試劑和溶液配制 除特別說(shuō)明外均購(gòu)自Sigma公司(St. Louis，MO，USA)。玻璃化冷凍液(vitrification solution, VS)的基礎(chǔ)液均為mPBS+0.5M蔗糖+18%聚蔗糖+0.4%BSA。

玻璃化冷凍液1(VS1)：平衡液為基礎(chǔ)液添加5%EG、5%DMSO；冷凍液為基礎(chǔ)液添加10%EG、10%DMSO。

玻璃化冷凍液2(VS2)：平衡液為基礎(chǔ)液添加10%EG、10%DMSO；冷凍液為基礎(chǔ)液添加20% EG、20%DMSO。

玻璃化冷凍液3(VS3)：平衡液為基礎(chǔ)液添加10%EG、10%DMSO；冷凍液為基礎(chǔ)液添加25%EG、25%DMSO。

解凍液：基礎(chǔ)液為T(mén)CM-199 +10%FCS+25mM Hepes，解凍液為基礎(chǔ)液中分別加入0.1 M、0.25 M和0.5 M蔗糖而成。

1.2 方 法

1.2.1 三種玻璃化冷凍液對(duì)牛卵母細(xì)胞的毒性試驗(yàn) 在20 ℃的室溫條件下，隨機(jī)將采集的COCs分成數(shù)量相近的7份，將其中一份直接進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，作為對(duì)照組；將另6份分別在不同濃度的平衡液中平衡10 min后，在相應(yīng)的玻璃化冷凍液(VS1、VS2、VS3)中暴露30 s或60 s，最后脫除冷凍劑，分別進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。將卵母細(xì)胞進(jìn)行染色并觀察，第一極體排出、細(xì)胞核達(dá)到MII期者為成熟卵母細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)成熟率。

1.2.2 三種玻璃化冷凍液對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精(In Vitro Fertilization,IVF)后發(fā)育能力的影響 將每次采集的COCs隨機(jī)分成數(shù)量相近的4份，其中1份直接進(jìn)行體外成熟(In Vitro Maturation,IVM)、IVF和早期胚胎體外培養(yǎng)(In Vitro Calture,IVC)，作為對(duì)照組；另3份分別在VS1、VS2、VS3中冷凍，冷凍采用OPS法[7]，解凍后再進(jìn)行IVM、IVF和IVC[8]，受精后2 d統(tǒng)計(jì)卵裂率，5～6 d統(tǒng)計(jì)桑椹胚數(shù)量并計(jì)算桑胚發(fā)育率，7～8 d統(tǒng)計(jì)囊胚數(shù)量并計(jì)算囊胚發(fā)育率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPASS 17.0 進(jìn)行方差分析，以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種玻璃化冷凍液對(duì)牛卵母細(xì)胞的毒性

表1表明，在20 ℃的室溫條件下，牛COCs在VS1中分別暴露30 s、60 s并經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后，成熟率分別為81.5%、78.9%，與對(duì)照組(81.6%)差異均不顯著(P>0.05)，但對(duì)照組、30 s組與60 s組依次呈下降趨勢(shì)。在VS2中分別暴露30 s、60 s并經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后，成熟率分別為78.5%和75.2%，與對(duì)照組差異亦均不顯著(P>0.05)，對(duì)照組、30 s組與60 s組間成熟率亦呈下降趨勢(shì)。在VS3中停留30 s時(shí)，成熟率為73.0%，與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，但60 s組成熟率僅為53.2%，明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。

表1 三種玻璃化冷凍液對(duì)牛卵母細(xì)胞的毒性Table 1 In vitro maturation rates of bovine COCs exposed to different vitrification solutions

注：同列肩標(biāo)字母不同者表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note：Values in same column with different superscripts differ significantly(P<0.01). The same below.

2.2 三種玻璃化冷凍液對(duì)IVF后發(fā)育能力的影響

表2表明，未經(jīng)冷凍的卵母細(xì)胞成熟率、卵裂率、桑椹胚率和囊胚率分別為80.7%、56.4%、20.6%和19.7%，而3個(gè)試驗(yàn)組的上述各指標(biāo)分別明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。3個(gè)試驗(yàn)組中，VS1、VS2和VS3組的卵母細(xì)胞成熟率分別為61.1%、67.9%±4.7和63.6%，3組間差異不顯著(P>0.05)；VS1、VS2和VS3組卵裂率分別為19.0%、33.9%和27.7%，VS2和VS3組明顯高于VS1組，但后二者間差異不顯著(P>0.05)；VS2組的桑椹胚率、囊胚率分別為6.3%和5.4%，與VS3組(5.0%、3.6%)差異不顯著(P>0.05)，VS1組桑椹胚率和囊胚率均為0。

表2 三種玻璃化冷凍液對(duì)牛卵母細(xì)胞IVF后發(fā)育能力的影響Table 2 Effect of three vitrification solutions on developmental competence of bovine oocyte following IVF

3 討 論

3.1 三種玻璃化冷凍液對(duì)牛卵母細(xì)胞的毒性

卵母細(xì)胞玻璃化冷凍的效果與玻璃化冷凍液中冷凍保護(hù)劑的濃度、作用時(shí)間等因素密切相關(guān)[9]，高濃度冷凍保護(hù)劑有可能因滲透壓及自身的化學(xué)毒性對(duì)卵母細(xì)胞產(chǎn)生一定程度的傷害[10]。在眾多研究及本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，本研究選擇三種不同濃度的玻璃化冷凍液進(jìn)行毒性試驗(yàn)。在VS1中，DMSO占10%，EG占10%，總濃度為2.89M；VS2中DMSO濃度為20%，EG濃度為20%，總濃度為5.78 M；VS3中DMSO濃度為25%，EG濃度為25%，總濃度達(dá)到7.19 M。在20℃的室溫條件下，將COCs分別置于上述幾種玻璃化冷凍液中30 s或60 s后再進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，對(duì)比其成熟率發(fā)現(xiàn)，當(dāng)卵母細(xì)胞與冷凍液的接觸時(shí)間控制在30 s以內(nèi)時(shí)，三種不同濃度的冷凍液對(duì)卵母細(xì)胞成熟率均沒(méi)有明顯影響。但是，隨著冷凍保護(hù)劑濃度的升高、卵母細(xì)胞在冷凍保護(hù)劑中停留時(shí)間的增加，毒性作用呈增加趨勢(shì)，在VS3中，DMSO和EG濃度各達(dá)25%(滲透性冷凍保護(hù)劑總濃度達(dá)50%)，當(dāng)作用時(shí)間增加到60 s時(shí)，對(duì)卵母細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的毒性。說(shuō)明冷凍保護(hù)劑的濃度越高、作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)卵母細(xì)胞造成的損傷越大。就本試驗(yàn)所選的三種玻璃化冷凍液而言，如果將其在室溫下的操作時(shí)間控制在30 s以內(nèi)，就不會(huì)影響卵母細(xì)胞成熟率。實(shí)際上，在冷凍過(guò)程中只要操作者技術(shù)熟練，并采用分批冷凍，可以將室溫下卵母細(xì)胞與玻璃化冷凍液的作用時(shí)間控制在30 s 以內(nèi)。

3.2 三種玻璃化冷凍液對(duì)牛卵母細(xì)胞IVF后發(fā)育能力的影響

目前，卵母細(xì)胞冷凍大多以MII期卵母細(xì)胞為冷凍材料，本試驗(yàn)以未經(jīng)成熟培養(yǎng)的COCs為冷凍對(duì)象，此時(shí)，其中的卵母細(xì)胞大多處于GV期。將COCs分別用VS1、VS2、VS3冷凍并解凍后，經(jīng)IVM、IVF和早期胚胎體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示VS2冷凍COCs的效果最好，雖然VS3組與VS2的冷凍效果沒(méi)有明顯差異，但由于VS3的濃度高于VS2，從盡可能減小冷凍保護(hù)劑濃度對(duì)細(xì)胞的毒性考慮，GV期卵母細(xì)胞的首選冷凍液應(yīng)是VS2。

本試驗(yàn)中， COCs經(jīng)玻冷凍、解凍和IVM后，三個(gè)試驗(yàn)組中VS2組的卵母細(xì)胞成熟率最高，為67.9%±4.7，但明顯低于對(duì)照組(80.7±5.6；P<0.05)，比試驗(yàn)1中VS2 30 s組的卵母細(xì)胞成熟率(78.5%±5.1，表1)低10.6%，說(shuō)明牛GV期卵母細(xì)胞冷凍后成熟率的降低主要受冷凍和解凍過(guò)程的影響，而不是由冷凍保護(hù)劑的毒性造成的。

冷凍保護(hù)劑在細(xì)胞內(nèi)外的平衡是決定細(xì)胞冷凍成功與否的關(guān)鍵，而牛COCs的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性決定了其不利于冷凍。據(jù)Massip[11]分析，卵母細(xì)胞周圍包被數(shù)層卵丘細(xì)胞，又是比較大的單細(xì)胞，使得冷凍保護(hù)劑進(jìn)入細(xì)胞的速度大大降低，從而影響了玻璃化冷凍的效率。鑒于此，在前人及本實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)選擇了三個(gè)配方(VS1、 VS2、VS3)做進(jìn)一步篩選試驗(yàn)，三個(gè)配方中均采用化學(xué)毒性較小、分子量小、滲透性強(qiáng)的DMSO和 EG作為細(xì)胞內(nèi)抗凍劑，以降低冷凍保護(hù)劑的毒性，提高滲透速度。本試驗(yàn)中，雖然VS2、VS3組分別獲得了5.4%、3.6%的囊胚率，但明顯低于對(duì)照組的19.7%，冷凍效果仍不理想，需要在理論和方法上進(jìn)行更多的深入研究。

參考文獻(xiàn):

[1] Vajta G, Holm P, Kuwayama M, et al. Open pulled straw (OPS) vitrification: a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos[J]. Mol Reprod Dev, 1998,51: 53-58.

[2] Wani N A, Maurya S N,Misra A K, et al. Effect of cryoprotectants and their concentrition on in vitro development of vitrified-warmed immature oocytes in buffalo (Bubalus bubalis) [J]. Theriogenology, 2004, 61:831-842.

[3] Mazur P, Seki S, Pinn I L, et al. Extra- and intracellular ice formation in mouse oocytes[J]. Cryobiology, 2005, 51:29-53.

[4] Pedro P B, Zhu S E, Makino N, Sakurai T, Edashige K, Kasai Met al. Effects of hypotonic stress on the survival of mouse oocytes and embryos at various stages[J]. Cryobiology, 1997, 35:150-158.

[5] Cha K Y, Chung H M, Lim J M, et al. Freezing immature oocytes[J]. Mol Cell Endocrinol, 2000, 169:43-47.

[6] Vanessa M, Weber B F, Marcelo D G, et al. Bovine oocyte vitrification: Effect of ethylene glycol concentrations and meiotic stages[J]. Anim Reprod Sci, 2008, 106:265-273.

[7] 禹學(xué)禮，鄧 雯， 龐有志，等. 開(kāi)放式拉長(zhǎng)細(xì)管冷凍法對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精效果的影響 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2005,3: 221-224.

[8] 禹學(xué)禮，鄧 雯，龐有志，等. 培養(yǎng)條件對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精后胚胎發(fā)育的影響 [J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版, 2005, 8: 16-20.

[9] Yamada C, Caetano H V, Simes R, et al. Immature bovine oocyte cryopreservation: Comparison of different associations with ethylene glycol, glycerol and dimethylsulfoxide[J]. Anim Reprod Sci, 2007, 99:384-388.

[10] Vanessa M, Weber B F, Marcelo D G, et al. Bovine oocyte vitrification: Effect of ethylene glycol concentrations and meiotic stages[J]. Anim Reprod Sci, 2008, 106:265-273.

[11] Massip A. Cryopreservation of bovine oocytes: current status and recent developments[J]. Reprod Nutr Dev, 2003, 43:325-330.