黃雅瓊，石德順，陳旭健，李家洲，曾詩媛，謝秋季，趙仕花，阮桂文

(1.玉林師范學院 生命科學與技術學院，廣西 玉林 537000 ；2.廣西大學 動物繁殖研究所，廣西 南寧 530005)

在生產實踐中，由于各種因素的影響，造成體細胞核移植效率低下的問題非常嚴重，制約了該技術的進一步發(fā)展和應用。供核體細胞是影響核移植效率的關鍵因素之一[1]。血清饑餓誘導G0期是哺乳動物體細胞核移植克隆成功的必要步驟[2]。誘導細胞進入G1和G2/M等時期可得到克隆后代[3-4]。血清饑餓處理供體細胞成為眾多研究者首選的方法[5]。在各種影響因素中，體細胞和卵母細胞細胞周期協調更是體細胞核移植最為關鍵的環(huán)節(jié)[6]。目前，卵母細胞體外發(fā)育質量及培養(yǎng)體系仍不完善，需進一步提高核移植重構胚的體外發(fā)育的潛能。本研究探討了胎兒成纖維細胞的不同處理方式等相關因素對核移植重構胚胎發(fā)育能力的影響，以期提高豬體細胞核移植重構胚胎的發(fā)育潛力。

1 材料與方法

1.1 卵母細胞的成熟

卵母細胞的采集和成熟培養(yǎng)采用黃雅瓊等[7-8]介紹的方法，將屠宰場采集的青年母豬的卵巢放在38 ℃加熱板上，抽取卵巢表面卵泡內的卵泡液和卵母細胞，在體視顯微鏡下挑選并收集具有完整卵丘細胞層和部分致密卵丘細胞的卵母細胞(卵丘-卵母細胞復合體)。在1 mL含有促卵泡素(FSH)0.1 μg/mL的成熟培養(yǎng)液(無血清的TCM-199基礎液+10%PFF+0.1%mg/mL cysteine)的培養(yǎng)液中，38.5 ℃、5% CO2和100%濕度的條件下，培養(yǎng)卵母細胞22～24 h，接著在不含FSH的成熟培養(yǎng)液中成熟培養(yǎng)22～24 h。培養(yǎng)44～48 h后，卵母細胞復合體用100 μL的移液槍反復輕輕吹打或者放入0.1%透明質酸酶5 min，除去顆粒細胞，然后逐一檢查第一極體(PB1)的排出情況，計算第一極體排出率，并以此計算卵母細胞的體外成熟率。

1.2 卵母細胞的激活

排出第一極體的卵母細胞首先放入5 μmol/L ionomycin(離子酶素：ION)中激活5 min，然后將清洗后的卵母細胞放入含有2 mmol/L 6-DMAP(6-二甲氨基嘌呤)中的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3～4 h。

1.3 豬胎兒成纖維細胞的準備

豬胎兒成纖維細胞作為供體細胞，胎兒成纖維細胞的收集方法參照文獻[9-10]。首先用PBS溶液清洗干凈胎兒組織，剪碎成1 mm3大小的組織塊，在37 ℃、5%CO2、100%濕度條件下貼壁培養(yǎng)于10%FCS的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)培養(yǎng)液中。當80%以上胎兒成纖維細胞細胞匯合后，用無Ca2+，Mg2+的PBS清洗原代細胞，再用0.25%胰蛋白酶的Hank's液2～3 mL消化3～5 min使胎兒纖維細胞分離，中止消化后，將胎兒成纖維細胞離心洗滌(800×g，5 min)，加入10%FCS的DMEM培養(yǎng)液中，制成1.0×106個細胞/mL的懸浮液，即可多次進行接種培養(yǎng)和傳代。

1.4 核移植重構胚胎的構建

將卵母細胞輕輕吹打或放入含0.1%透明質酸酶的培養(yǎng)液中輕輕反復吹打，除去卵母細胞外顆粒細胞后獲得裸卵，挑選其中具有第一極體、細胞質均勻的成熟良好的卵母細胞移入含有5 μg/mL細胞松弛素B+TCM199+5 mmol/L Hepes+5 mmol/L NaHCO3+5%OCS的培養(yǎng)液中，置于顯微操作儀的載物臺上。用盲吸法去核和Hochest33342染色法進行染色[8-9]，確認去核后的卵母細胞放入胚胎培養(yǎng)液(NCSU-23+0.3%BSA)中30 min促進形態(tài)的恢復。用含有0.25%胰蛋白酶消化分離和處理胎兒成纖維細胞，將纖維細胞和恢復后的卵母細胞移入操作盤，構建卵母細胞-胎兒成纖維細胞復合體。

1.5 核移植重構胚胎的融合與激活和培養(yǎng)

將卵母細胞-胎兒成纖維細胞復合體放在融合液0.28 mol/L甘露醇+0.05 mmol/LCaCl2+0.1mmol/LMgSO4+5 mmol/LHepes+0.1%BSA+5mg/L酚紅溶液中，施加電流進行融合。在38.5℃、5%CO2、100%濕度的條件下培養(yǎng)電融合后的卵母細胞-供體細胞復合體30 min～60 min，在顯微鏡下檢查融合情況，注入卵周隙的胎兒成纖維細胞進入去核后的卵母細胞的胞質內，卵母細胞與供體細胞融合為一體即為重構胚胎。計錄各組融合數及融合率[11]。將融合激活后的重構胚胎用豬胚胎培養(yǎng)液NCSU-23(North Carolina State University-23，NCSU-23)溶液在38.5 ℃，含5%CO2的空氣和100%濕度的條件下培養(yǎng)48 h后觀察分裂率。每2 d將進行重構胚胎培半換液1次，6～9 d記錄囊胚率。重構胚胎的融合率為融合卵數/NT卵數的比率；重構胚胎的卵裂率為分裂卵數/培養(yǎng)卵數的比率；重構胚胎的囊胚率為囊胚發(fā)育卵數/分裂卵數的比率。

1.6 試驗設計

試驗一：采用血清饑餓法和接觸抑制法誘導第6代胎兒成纖維細胞進入G0/G1期，以70%～80%匯合的胎兒成纖維細胞作對照組，進行70%～80%接觸、完全接觸抑制法(100%長滿)和血清饑餓法(0.5%FCS+DMEM)比較，探討三種處理胎兒成纖維細胞的方法對重構胚胎體外發(fā)育的影響。

試驗二：分別用常規(guī)傳代消化、4 ℃冷藏和冷凍-解凍的第6代胎兒成纖維細胞作為供體細胞，分析核移植胚胎的發(fā)育潛力。

試驗三：分別用酶消化法和組織塊法分離培養(yǎng)的胎兒成纖維細胞作為供體細胞構建核移植胚胎，分析不同方法對核移植胚胎發(fā)育潛力的影響。

1.7 統計分析

所有試驗數據采用INSTAT統計軟件進行卡方(x2)分析檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同傳代培養(yǎng)方法對核移植胚胎發(fā)育潛力的影響

胎兒成纖維細胞不同傳代的培養(yǎng)方法對核移植胚胎發(fā)育潛力的影響見表1。由表1知，完全接觸抑制組融合率較高，與對照組相比差異顯著(P<0.05)，接觸抑制組分裂率與血清饑餓組分裂率相比，差異顯著(P<0.05)，但各組之間的囊胚率差異不顯著(P>0.05)。70%～80%接觸、完全接觸抑制法(100%長滿)和血清饑餓法(0.5%FCS+DMEM)是三種調節(jié)供體細胞進入G0/G1期的有效的同期化處理胎兒成纖維細胞作為供體的方法。

2.2 成纖維細胞對核移植胚胎發(fā)育潛力的影響

在常規(guī)消化(Routine Digestion)情況中，即正常傳代消化分離的胎兒成纖維細胞直接用，一部分收集于Eppendorf離心管中，放于4 ℃冷藏，液氮( 196 ℃)冷凍解凍(37 ℃)的胎兒成纖維細胞復蘇后收集做為供體細胞，構建重構胚胎。三種方法的結果見表2。由表2知，豬胎兒成纖維細胞冷凍解凍后的核移植分裂率和囊胚發(fā)育率均顯著低于新鮮和4 ℃冷藏的細胞(P<0.05)。雖然融合率無顯著差異(P>0.05)，但豬胎兒成纖維細胞解凍后不宜直接進行核移植。

表1 胎兒成纖維細胞的不同傳代的培養(yǎng)方法對核移植胚胎發(fā)育潛力的影響Table 1 Effects of different passage culture methods of fetal fibroblasts on embryos developmentalcapacity of porcine somatic cells nuclear transfer

注：同列數據肩標為不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母或相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；括號內數字分別是融合率、分裂卵率、囊胚率。下同。

Note:Values with different small letter superscripts in the same column mean significant difference(P>0.05),while those with the same letter or without superscripts mean insignifiant difference(P>0.05)；Numbers in the brackets are respectively fusion rate, cleavage rate and blastocyst rate.The same below.

表2 不同方法處理的胎兒成纖維細胞對核移植胚胎發(fā)育潛力的影響Table 2 Effects of different treatment methods of fetal fibroblasts on embryos developmental capacity of porcine somatic cells nuclear transfer

2.3 不同分離培養(yǎng)方法對核移植胚胎發(fā)育的影響

用組織塊和酶消化法分離培養(yǎng)的胎兒成纖維細胞對核移植胚胎發(fā)育潛力的影響見表3。表3表明，兩種分離方法分離得到的胎兒成纖維細胞構建的重構胚胎在融合率、分裂率和囊胚率方面沒有顯著差異(P>0.05)。組織塊和酶消化法分離方法均是分離培養(yǎng)的胎兒成纖維細胞細胞的方法。

表3 胎兒成纖維細胞不同分離培養(yǎng)方法對重構胚胎發(fā)育潛力的影響Table 3 Effects of different cell dissociate culture methods of fetal fibroblasts on embryos developmental capacity of porcine somatic cells nuclear transfer

3 討 論

3.1 胎兒成纖維細胞不同傳代的培養(yǎng)方法對核移植胚胎發(fā)育潛力的影響

調節(jié)細胞周期的方法有血清饑餓法、接觸抑制法、誘導法及輔助用化學試劑調節(jié)等方法。目前，血清饑餓法、接觸抑制法較常用，很多克隆動物都由這兩種方法獲得[12-14]。血清饑餓法是經典的調節(jié)細胞周期的方法，首例體細胞克隆綿羊“Dolly”等多種動物克隆成功都是采用將供體細胞調節(jié)至G0/G1期而實現[15-18]。Beyhan等[19]和Ono等[20]研究表明，供體細胞處于G0/G1狀態(tài)下有利于核移植重構胚胎發(fā)育。因此，供體細胞處于G0/G1階段是體細胞核移植重構胚胎進行重編，啟動發(fā)育的重要因素。通?？衫眉毎N壁生長接觸抑制的特性將其調節(jié)到G0/G1期，體細胞在體外貼壁培養(yǎng)并接觸抑制時，70%左右的細胞處于G0/G1期的細胞生長周期內[21-23]，100%匯合的供體細胞自然停止生長，其細胞周期達到靜止期。本試驗結果表明，胎兒成纖維細胞在完全接觸抑制組的融合率較高，接觸抑制組分裂率顯著高于血清饑餓組，但不同處理間的囊胚率差異不顯著。血清饑餓處理的細胞DNA碎片明顯較高，影響核移植的效率[23-24]。Bochenek等[25]研究表明，血清饑餓處理并不能顯著增加成纖維細胞處于G0/G1期細胞的比率。Kues等[23]研究證實，血清饑餓培養(yǎng)時間延長會導致大量的DNA碎裂；降低培養(yǎng)液中血清濃度可以盡量維持細胞不分化的狀態(tài)，降低細胞的生長速度，調節(jié)細胞生長狀態(tài)，不發(fā)生增殖，從而使細胞達到周期一致。血清饑餓處理對囊胚的早期發(fā)育沒有明顯的促進[26-29]。誘導細胞進入G1和G2/M等時期可得到克隆后代[3-4]。Vignon等[30]和Cibelli 等[31]等不經血清饑餓同樣得到了克降動物，這說明供體細胞可以不需要血清饑餓。Kasinathan等[3]研究發(fā)現，分別從25%和100%匯合程度人供體細胞分離出來的G1期細胞為供體細胞，其重構胚胎的囊胚的細胞數量和囊胚率都沒有明顯區(qū)別。這說明可能細胞的匯合程度并不能做為判斷細胞周期同期化程度的標準。多數研究者均認為，血清饑餓和接觸抑制可以提高供體細胞處于G0/G1周期階段的數量，G0/G1周期階段的供體細胞有利于重構胚胎的發(fā)育和克隆動物的成功[15-19]。

Boquest等[22]認為沒有一種最佳方法調節(jié)細胞周期完全達到(100% G0/G1)周期同步的要求，而Woods等[5]采用血清饑餓的方法處理供體細胞。本試驗研究結果表明，胎兒成纖維細胞70%～80%接觸、完全接觸抑制法(100%長滿)和血清饑餓法(0.5%FCS + DMEM)三種方法均可有效地同期化供體細胞周期。對于供體細胞周期的問題，Enright等[32]建議通過監(jiān)測細胞周期同期化建立預測克隆胚胎命運的模型。對于供體細胞的周期同步調節(jié)問題上，細胞的處理方法、血清的成分、血清濃度、血清培養(yǎng)時間、細胞生長的最佳密度、細胞生長的合適時間、促進細胞生長的調節(jié)因子、細胞生長的影響因素、影響細胞生長的處理和調控方法等還需要進一步研究。

3.2 不同處理方法對核移植胚胎發(fā)育潛力的影響

使用胎兒成纖維細胞為供體，探討在常規(guī)消化法、4 ℃冷藏法和液氮( 196 ℃)冷凍與解凍(37 ℃)法處理后，對豬重構胚胎發(fā)育潛力。常規(guī)消化法和冷藏方法可有效處理胎兒成纖維細胞。Liu等[33]成功得到了冷藏2～5 d后的牛囊胚；Guo等[34]成功得到了冷藏細胞克隆的山羊后代。據王立芳[35]報道，成功得到冷凍細胞克隆的種間水牛。張運海[29]研究表明，冷藏的細胞支持囊胚發(fā)育效率沒有受到不利影響，也獲得首例用冷藏的豬體細胞表達綠色熒光蛋白的克隆囊胚。新鮮解凍的供體細胞步驟較復雜，可利用的傳代次數也不多，效率低，所以人們通過冷凍/解凍供體細胞的方法來保證核移植的供體細胞的需要。本試驗中，對胎兒成纖維細胞冷凍/解凍后，發(fā)現冷凍效果不理想，可能是大部分細胞受到了冷凍損傷，造成重構胚胎的卵裂率降低；豬胎兒成纖維細胞冷凍解凍后的核移植分裂率和囊胚發(fā)育率均顯著低于新鮮和4 ℃冷藏的細胞，說明豬胎兒成纖維細胞解凍后不宜直接進行核移植。本試驗中胎兒成纖維細胞所構建的核移植重構胚胎出現分裂到細胞的不同階段，沒有得到冷凍解凍后的胎兒成纖維細胞構建的核移植囊胚。其原因可能是胎兒成纖維細胞在冷凍解凍過程中，胎兒成纖維細胞冷凍所形成的細胞內的冰晶融解后，對胎兒成纖維細胞的亞顯微結構成一定程度的損壞，胎兒成纖維細胞的由于冷凍損傷而活力下降。另外，由于使用方法不同及條件差異，造成試驗結果不盡相同，本試驗中，胎兒成纖維細胞冷凍解凍的重構胚胎不能發(fā)育至囊胚階段。

3.3 不同分離培養(yǎng)方法對核移植胚胎發(fā)育潛力的影響

酶消化法和組織塊培養(yǎng)法是常規(guī)的細胞分離培養(yǎng)方法。王啟鳳等[36]利用胰蛋白酶消化供體細胞易受pH、溫度、組織的硬度以及酶的濃度、消化時間和消化液濃度等因素的影響，導致細胞損傷，不易貼壁。因此，在使用酶消化法分離的細胞作為供體細胞時，會影響核移植胚胎的發(fā)育潛力。組織塊培養(yǎng)法獲得細胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)規(guī)則整齊，取材方便，成本低，但原代細胞生長慢，細胞傳代時間長。研究表明，組織塊的采樣為1 cm2左右為宜，這可降低對動物健康狀況和應用價值的影響[37-40]。蔡文琴[41]研究發(fā)現，組織塊法進行培養(yǎng)可提高培養(yǎng)成功率。本試驗中，采用酶消化法和組織塊法分離得到的供體細胞構建的重構胚胎的融合率(60.15%和67.72%)、分裂率(64.34%和60.63%)和囊胚率(17.39%和14.92%)沒有顯著差異，這說明兩種胎兒成纖維細胞分離培養(yǎng)方法均為有效的分離培養(yǎng)方法，可支持重構胚胎的構建和發(fā)育。

4 結 論

結果表明，100%長滿匯合培養(yǎng)是較好的豬胎兒成纖維細胞培養(yǎng)處理方法；豬胎兒成纖維細胞解凍后不宜直接進行核移植；組織塊法和酶消化法均可用于分離培養(yǎng)豬體細胞核移植的胎兒成纖維細胞。

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