苗永旺，孫利民，童晶晶，李大林，袁躍云，楊滿燦，郝偉峰，霍金龍，楊 潤，余仕亮，楊光強，王 群

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2. 云南省家畜改良工作站，云南 昆明 650225；3. 云南省普洱市畜牧工作站, 云南 普洱思茅區(qū)665000；4. 云南省景東縣畜牧工作站，云南 景東676200)

云南境內的無量山、哀牢山兩山脈之間大多地區(qū)海拔高差大，地形地貌復雜氣候明顯。在該地區(qū)獨特的自然生態(tài)環(huán)境條件下，經(jīng)過當?shù)鼐用耖L期的選育形成了獨特的地方雞種資源。2009年9月經(jīng)國家畜禽遺傳資源委員會現(xiàn)場鑒定，把分布于無量山、哀牢山地區(qū)的烏骨雞資源統(tǒng)稱為無量山烏骨雞[1]。2011年將之收錄到《中國畜禽遺傳資源志·家禽志》中[2]。據(jù)統(tǒng)計，2006年該雞存欄84萬只。近年存欄逐年增加，群體數(shù)量呈上升趨勢。無量山烏骨雞為常羽烏骨雞，毛色有麻花、黃、白等色。該雞體大結實，適應性強，烏皮、烏骨、烏肉，肉質極佳。中心產(chǎn)區(qū)為云南普洱市景東縣、鎮(zhèn)沅縣和大理州南澗縣。在普洱市的墨江、景谷、寧洱等縣，大理州的漾濞、永平、巍山和云龍等縣也有分布。由于無量山烏骨雞分布的地理區(qū)域廣，在其大群體內形成了具有一定遺傳和生產(chǎn)性能差異的地方雞群體。差異比較明顯的是以分布在普洱景東縣及鄰近地區(qū)的普洱毛腳烏雞群體和以分布在大理南澗縣的綠耳烏雞群體為代表。在外觀上，普洱毛腳烏雞體型高大，屠宰率高，通常腳有脛羽、趾羽，故稱“毛腳雞”。毛腳性狀在雞群中較普遍存在，但綠耳性狀只是零星存在。而南澗綠耳烏雞體型中等，綠耳性狀在群體中普遍存在，但毛腳性狀特征在群體中不顯著。過去，人們對該地區(qū)家雞研究較少，對其群體遺傳背景和種質遺傳特性知之甚少。采用現(xiàn)代遺傳學手段對分布于無量山、哀牢山地區(qū)不同類型的烏骨雞群體進行遺傳背景分析，找出它們間的遺傳差異，對開發(fā)利用該地區(qū)優(yōu)良地方雞種資源具有重要意義。

高等生物的線粒體DNA(mtDNA)進化速率比核基因高數(shù)倍，其控制區(qū)(D-loop region)突變速度又較其它區(qū)域高。因此，mtDNA D-loop積累突變較多，作為遺傳標記用于種下遺傳多樣性和群體遺傳組成分析，效果好、靈敏度高[3-4]。目前，世界家雞的mtDNA世系組成及其分布已基本清楚[5-6]，這為我國地方雞種的遺傳分析奠定了基礎。本研究以mtDNA D-loop第I高變區(qū)長520 bp的序列為遺傳標記，對普洱毛腳烏雞和南澗綠耳烏雞兩個地方雞群體進行了變異檢測和系統(tǒng)發(fā)育、群體遺傳組成分析，以期為云南哀牢山、無量山地區(qū)烏骨雞種質資源的類群劃分、保護和選育利用提供遺傳背景資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究共采集家雞樣品96份，其中包括普洱毛腳烏雞樣品48份(♀：25, ♂：23)、南澗綠耳烏雞樣品48份(♀：24, ♂：24)。樣品分別采自云南省普洱市景東縣和大理州南澗縣，在核心產(chǎn)區(qū)隨機取樣，樣本個體間不存在直接血緣關系。翅下靜脈采血，每只雞2 mL，與DNA保存液混合后，低溫帶回實驗室，用于基因組DNA提取。

1.2 基因組DNA提取

參照苗永旺等[7]的方法提取基因組DNA，經(jīng)檢測其純度和濃度，稀釋成100 ng/μL，用于后續(xù)群體變異檢測分析。

1.3 PCR擴增及序列測定

采用Liu等[5]的引物進行目的片段擴增和測序：正向引物：5'-AGGACTACGGCTTGAAAAGC-3'；反向引物：5'-ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG-3'。

PCR反應體系總體積為25 μL，含模板DNA(50～100 ng)1 μL，ddH2O 19.375 μL，10×Buffer 2.5 μL(Mg2+濃度15 mM)，dNTP(各2.5 mM)1 μL，正、反向引物(20 μM)各0.5 μL，Taq酶(TaKaRa)0.125 μL。

PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；然后94 ℃ 1 min，63 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，運行35個循環(huán)；再72 ℃延伸5 min，最后4 ℃終止反應。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠(1.5%)電泳檢測后，采用試劑盒(Promage產(chǎn)品)進行回收純化，送百泰克生物技術有限公司進行正、反鏈雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用DNAstar軟件包(DNAstar Inc.)對所得序列進行核對，然后使用ClustalX軟件進行序列比對，再用DnaSP 5.0軟件[8]對群體的多態(tài)位點數(shù)、單倍型數(shù)、單倍型多樣度和核苷酸多樣度及核苷酸差異數(shù)等參數(shù)進行分析。序列堿基組成分析、突變位點輸出、遺傳距離計算和無根系統(tǒng)樹的構建，采用MEGA 4.0軟件[9]完成。本文序列單倍型的定義以NCBI數(shù)據(jù)庫中一條紅原雞序列NC_007235為參考序列。

2 結果和分析

2.1 序列變異分析

本研究96個家雞樣品mtDNA D-loop序列長度均為520 bp，共檢測到31個多態(tài)位點，其中單一變異位點2個，簡約信息位點29個。根據(jù)突變位點定義19種單倍型。單倍型多樣度為0.884±0.019，核苷酸多樣度為0.01586±0.00035；序列核苷酸差異平均數(shù)為8.250。序列堿基組成A、G、T和C的平均含量分別為27.4%、12.6%、30.2%和29.8%。

在普洱毛腳烏雞中，共檢測到24個核苷酸多態(tài)位點，序列變異率為4.81%，其中單一變異位點2個，簡約信息位點22個；序列中T、C、A和G的平均含量分別為30.2%，29.8%，27.4%和12.7%；共定義12種單倍型，獨有單倍型為6個，占該群體單倍型總數(shù)的50%(6/12)。該群體單倍型多樣度為0.829±0.039，核苷酸多樣度為0.01559±0.00068；群體內序列間核苷酸差異的平均數(shù)是8.106，群體內遺傳距離為0.016±0.003。在南澗綠耳烏雞中共檢測到28個核苷酸多態(tài)位點，序列變異率為5.58%，其中單一變異位點0個，簡約信息位點28個，共定義了13種單倍型，獨有單倍型為7個，占該群體單倍型總數(shù)的53.85%(7/13)。序列堿基A、G、T和C的平均含量分別為27.4%、12.6%、30.3%和29.7%，單倍型多樣度為0.907±0.018，核苷酸多樣度為0.01590±0.00056，序列間平均核苷酸差異數(shù)是8.270，群體內遺傳距離也為0.016±0.003。兩群體間遺傳距離為0.019±0.004。在兩群體中檢測到的變異位點及其單倍型世系分布信息見表1。

2.2 群體遺傳分化和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用鄰接法(Neighbor-jointing, NJ)構建的無根系統(tǒng)樹見圖1和圖2。在系統(tǒng)發(fā)育樹上，普洱毛腳烏雞序列聚為5大支，而南澗綠耳烏雞聚為6大支。按照Miao等[6]的家雞mtDNA世系劃分及各世系突變模式，可將本研究所有個體劃分到已命名的家雞A、B、C、E、F和G等世系中。普洱毛腳烏雞與南澗綠耳烏雞的世系劃分與各自系統(tǒng)樹上的支系相一致。普洱毛腳烏雞包含A，B，E，F(xiàn)和G五個世系，其中A世系占45.83%，B世系占2.08%，E世系占8.33%，F(xiàn)世系占16.67%，G世系占27.09%。A世系在該雞群體中占優(yōu)勢，其次是G世系。南澗綠耳烏雞包含A，B，C，E，F(xiàn)和G六個母系世系，其中A世系占22.92%，B世系占14.58%，C世系占4.17%，E世系占10.42%，F(xiàn)世系占16.67%，G世系占31.25%。G世系在該雞群體中占優(yōu)勢，其次是A世系。

表1 多態(tài)位點信息及所定義的單倍型Table 1 The information of the polymorphic sites, lineage and defined haplotypes

注：ST:為序列NC_007235；圖中點(o)代表與參考序列核苷酸相同；Maojiao代表普洱毛腳烏雞; Lver代表南澗綠耳烏雞。

Note：ST:the sequence NC_007235; Dots (o) are identified with the reference sequence；Miaojiao：Puer maojiao black-bone chicken；Lver: Nanjian Lver black-bone chicken.

圖1 基于普洱毛腳烏雞所有樣品mtDNA D-loop序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on mtDNA D-loop sequences of Puer Maojiao black-bone chicken

圖2 基于南澗綠耳烏雞所有樣品mtDNA D-loop序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on mtDNA D-loop sequences of Nanjian Lver black-bone chicken

3 討 論

相對于單倍型多樣度而言，核苷酸多樣度不受樣本大小和序列長度的影響，是衡量群體遺傳多樣性的可靠指標。本研究在48只普洱毛腳烏雞中發(fā)現(xiàn)24個核苷酸多態(tài)位點，序列變異率為4.81%，核苷酸多樣度為0.01559±0.00068。而在南澗綠耳烏雞中共發(fā)現(xiàn)28個核苷酸多態(tài)位點，序列變異率為5.58%，核苷酸多樣度為0.01590±0.00056。這表明南澗綠耳烏雞的遺傳多樣性水平高于普洱毛腳烏雞。近年，已有人采用相同的序列區(qū)段為遺傳標記，分析了我國一些地方雞種的遺傳多樣性。已報道，云南華坪烏骨雞群體的核苷酸多樣度為0.01547±0. 00085[10]，與本研究的兩個云南地方雞群體相近。對仙居雞、靈昆雞、來航雞、白銀耳雞、蕭山雞、白羽烏骨雞的檢測顯示，這些雞種的核苷酸多樣度從0.00111～0.1239不等，平均值為0.01183[11-13]。包文斌等[13]對中國14個地方雞種的遺傳分析顯示，各群體核苷酸多樣度從0.000～0.01963不等，其中有10個群體核苷酸多樣度均在0.01510以下。這表明，普洱毛腳烏雞和南澗綠耳烏雞遺傳多樣性在我國地方雞種中處于較高的水平，揭示其群體遺傳多樣性豐富。這與它們飼養(yǎng)管理粗放，選育程度低的實際情況相符。

Liu等[5]采用相同的遺傳標記對家雞和紅原雞的mtDNA世系及遺傳分化的研究表明，世界家雞和紅原雞共包含9個世系，這些世系存在一定的系統(tǒng)地理分布。最近，Miao等[6]基于家雞線粒體全基因組序列構建了mtDNA系統(tǒng)發(fā)育樹并對單倍型類群進行了詳細界定，基于該系統(tǒng)發(fā)育樹，對世界各地大樣本mtDNA控制區(qū)序列進行了重新分析，確定世界家雞及其近緣種紅原雞可分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、W和X等世系，從而揭示出分別發(fā)生在南亞和中國西南及其鄰近東南亞地區(qū)的局部馴化事件。本研究普洱毛腳烏雞樣品具有A、B、E、F和G等5世系；而南澗綠耳烏雞擁有A、B、C、E、F和G等6世系。這表明普洱毛腳烏雞在群體遺傳組成上具有5個母系血統(tǒng)來源，而南澗綠耳烏雞具有6個母系血統(tǒng)來源，支持家雞多個母系起源的觀點[5-6]。但兩個家雞群體的遺傳組成存在明顯差異：普洱毛腳烏雞中未發(fā)現(xiàn)有C世系，A世系占的比例最多，其次為G世系，第三大世系為F世系，B世系占的比例最少；A、G和F世系三者的比例為89.59%。而在南澗綠耳烏雞中，G世系占的比例最多，其次為A世系，F(xiàn)世系為第三大世系，A、G和F世系三者的比例為72.42%；該雞中B世系的比例明顯高于普洱毛腳烏雞，但F世系的比例與普洱毛腳烏雞相當。從單倍型來看，普洱毛腳烏雞中獨有單倍型占50%，而南澗綠耳烏雞中獨有單倍型占53.85%，這表明兩者群體具有較大遺傳差異。同時，兩群體間遺傳距離為0.019±0.004，大于各自群體內遺傳距離，揭示兩群體存在一定遺傳分化。普洱毛腳烏雞主要分布于哀牢山地區(qū)，而南澗綠耳烏雞主要分布于無量山地區(qū)，兩者的遺傳差異可能與兩地家雞群體的長時間隔離、遺傳漂變及兩地居民的養(yǎng)殖習慣和選育差異有關。

根據(jù)現(xiàn)有世界家雞的mtDNA世系地理分布[5-6]，A和B世系為東亞和東南亞地區(qū)普遍存在的世系，C世系為東亞特有世系，E為南亞和歐美商品雞中普遍存在的世系，F(xiàn)和G為云南及相鄰地區(qū)特有世系。本研究普洱毛腳烏雞群體中云南特有世系占43.76%，東亞和東南亞地區(qū)(含云南)血統(tǒng)占91.67%；南澗綠耳烏雞中云南特有世系占47.92%，東亞和東南亞地區(qū)(含云南)血統(tǒng)占89.58%。這揭示這兩個地方雞群體在母系血統(tǒng)上主要為東亞和云南及云南周邊地區(qū)地方雞血統(tǒng)。但在它們群體中還有少量的屬于南亞和西方商品雞中普遍存在的血統(tǒng)(E世系)，提示它們可能存在一定比例的歐美商品雞血液滲入。

4 結 論

本研究從母系遺傳角度揭示了云南境內哀牢山地區(qū)普洱毛腳烏雞和無量山地區(qū)南澗綠耳烏雞的遺傳多樣性和遺傳差異。兩者群體遺傳多樣性較高，南澗綠耳烏雞的遺傳多樣性相對高于普洱毛腳烏雞。兩個地方雞群體存在一定遺傳分化，它們的群體遺傳組成明顯不同，揭示兩群體遺傳差異較大。在血統(tǒng)來源上，兩者主要為地方土雞血統(tǒng)，但可能有少量商品雞血液滲入。有關它們的遺傳差異還有必要采用核基因標記進行深入研究。本研究可為哀牢山-無量山地區(qū)烏骨雞種質資源的類群劃分和保護提供依據(jù)。

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