余冬冬，耿果霞，張成娟，劉亞偉，胡靚華，曹華琳，李青旺*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.山東省安丘市人民醫(yī)院，山東 安丘 052164)

精原干細胞(spermatogonial stem cells, SSCs)是指位于雄性哺乳動物睪丸的曲細精管生精上皮基膜內(nèi)側(cè)的一群具有高度自我更新能力和分化潛能的細胞，在哺乳動物中一般是指未分化的A型精原細胞[1]。作為一類原始的精原細胞，SSCs既能自我更新生成新的干細胞從而維持自身群體穩(wěn)定，又能定向分化形成各階段的生殖細胞，并能最終分化形成精子[2]。SSCs通過分化成精子而能向子代傳遞遺傳信息，在雄性動物的精子發(fā)生過程中，SSCs的地位極其重要，SSCs是體內(nèi)唯一的，能在細胞水平進行識別并研究其增殖、分化及調(diào)控的一種成體干細胞[3]。由于SSCs獨具的生物學(xué)特性，對于干細胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域均具有重要的理論和實踐意義。

紅景天多糖(Rhodiola Sachalinensis polysaccharides,RSP)為景天科景天屬(Rhodiola)植物的干燥根及莖的多糖提取物，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖與半乳糖醛酸組成的多糖[4]。近代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，紅景天多糖具有抗疲勞、抗寒、抗氧化、抗衰老、耐缺氧、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血糖和抗細胞凋亡等多種生物活性，成為近年研究開發(fā)的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，紅景天多糖對體外培養(yǎng)的人胃癌細胞具有明顯的抑制作用[5]。雖然如此，但關(guān)于紅景天多糖對于SSCs體外培養(yǎng)的作用未見相關(guān)報道。試驗通過Sertoli細胞與SSCs細胞共培養(yǎng)的培養(yǎng)液中加入紅景天多糖，對比了不同濃度的紅景天多糖的作用，以堿性磷酸酶(AP)和RT-PCR為鑒定依據(jù)，探討紅景天多糖對SSCs體外增殖的影響，探尋促進SSCs體外增殖的方法，以期為促進SSCs體外培養(yǎng)提供一些參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 本研究小鼠為出生后6～8 d的健康、清潔級雄性昆白小鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院試驗動物中心提供。

1.1.2 紅景天多糖的提取 參考張樹山等[6]介紹的方法，將紅景天粉碎后置于80 ℃蒸餾水浸泡5 h后取其上清液，然后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，凍干處理經(jīng)粉碎后所獲得粉末即為紅景天多糖，將其密封后置于室溫保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 SSCs的分離和純化 每次試驗分別取仔鼠4 ～10只，脫頸處死后，無菌取出睪丸。去除附睪、白膜等，將暴露出來的曲細精管切成小段，并反復(fù)吹打。先用10倍體積于組織塊的Ⅳ型膠原酶(1 mg/mL)和少量DNaseⅠ(1 mg/mL)消化30 min，以除去間質(zhì)細胞和一些血管成分，消化期間每隔5 min搖動一次。 再加入10倍體積的胰蛋白酶(0.25%)消化5 min，期間不斷吹打，然后用含10% 胎牛血清的等量DMEM終止消化。接著將細胞懸液移入離心管中以800 r/min 離心5 min，將收集后的細胞接種于含10 % 胎牛血清的DMEM(預(yù)先加入100 U/mL的青霉素、鏈霉素)培養(yǎng)皿內(nèi)，未消化的組織成分用400目的細胞篩過濾除去，隨后于37 ℃、5 % CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。根據(jù)SSCs和Sertoli細胞貼壁速度的不同進行進一步的純化。

1.2.2 Sertoli細胞飼養(yǎng)層的制備 根據(jù)貼壁速度不同，將體外培養(yǎng)4 h后的未貼壁的精原細胞吸去，加入含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。選擇生長較密集的Sertoli細胞培養(yǎng)皿，棄去原培養(yǎng)液，用10 μg/L的絲裂霉素C處理細胞4 h后，用胰蛋白酶消化收集細胞，重新加入含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，待細胞貼壁后即可作為飼養(yǎng)層。

1.2.3 SSCs共培養(yǎng) 將分離獲得的SSCs以約 1×105/cm2接種在預(yù)先制備好的Sertoli飼養(yǎng)層細胞上，每隔2 d更換1次培養(yǎng)液。基礎(chǔ)培養(yǎng)液為DMEM培養(yǎng)液+100 U/mL青霉素和鏈霉素+1% 谷氨酰胺+1% 非必需氨基酸+1% 丙酮酸鈉+體積分數(shù)10% 胎牛血清，再在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中分別加入0、100、200、300和400 ng/mL 紅景天多糖，以不加入紅景天多糖組為對照，每個處理有三個重復(fù)組，每隔48 h 觀察細胞形態(tài)并檢測其增殖狀況。

SSCs增殖情況檢測時，將SSCs在37 ℃ 用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)處理4 h，除去上清液，加入DMSO后置搖床上振蕩20 min，以充分溶解藍紫色結(jié)晶物甲瓚，用酶標儀于490 nm 處測量各孔的吸光值(OD490)。

1.2.4 SSCs的鑒定

1.2.4.1 堿性磷酸酶(AP)染色檢測 將待染色的SSCs用PBS洗2次，加入4% 多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗2次，25 mL Tris-HCl(pH 9.0)漂洗1次，然后用NBT/BCIP AP顯色試劑盒染色，避光孵化15～30 min后，PBS漂洗終止反應(yīng)，400倍倒置顯微鏡下觀察。

1.2.4.2 RT-PCR檢測標記基因 取培養(yǎng)1周左右的SSCs，使用RNA提取試劑盒抽提細胞總RNA，兩步法進行RT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min預(yù)變性，94 ℃ 30 s變性，58 ℃ 40 s退火，72 ℃ 1 min延伸，30個循環(huán)，72 ℃ 5 min終末延伸，以β-actin基因為內(nèi)參照，對獲得的RT-PCR產(chǎn)物進行1 % 瓊脂糖電泳檢測，相關(guān)基因的引物序列見表1。

1.3 數(shù)理統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行單因素ANOVA方差分析，P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼鼠SSCs的形態(tài)

體外培養(yǎng)1周后，添加紅景天多糖組均較對照組SSCs明顯增加，其中添加量為300 ng/mL 的細胞生長最好。培養(yǎng)1周后的細胞形成了克隆團，且AP染色呈紅棕色(見圖1)。

表1 相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primers designed for related genes

2.2 幼鼠SSCs的RT-PCR鑒定

標記基因的檢測見圖2。由圖2可知，463 bp的β-actin 基因、395 bp 的GFRa-1基因以及369 bp的Thy-1基因均在目的細胞中表達，表明試驗分離獲得的細胞為SSCs。

2.3 紅景天多糖對SSCs的增殖作用

精原干細胞增殖的MTT檢測見圖3。如圖3所示，培養(yǎng)至第2 d時，除添加量為100 ng/mL組外，其余試驗組OD490較對照組均差異顯著(P<0.05)，各試驗組間差異顯著(P<0.05)；而培養(yǎng)至第4 d時，試驗組與對照組OD490均差異顯著(P<0.05)，添加400 ng/mL組與100 ng/mL和200 ng/mL組間差異不顯著(P>0.05)，而其余組間均差異顯著(P<0.05)，增殖率最高可達152%。

圖1 小鼠精原干細胞的AP染色(400×)Fig.1 AP staining for mouse spematogonial stem cells(400×)

圖2 標記基因的檢測Fig.2 Identification of mouse SSCs with marker genes

圖3 精原干細胞增殖的MTT檢測Fig.3 MTT test for the proliferation of spermatogonial stem cells

3 討 論

紅景天為景天科景天屬(Rhodiola)多種植物的干燥根及莖，具有抗疲勞、抗寒、抗衰老、抗微波輻射、耐缺氧、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血糖等多種功能，作為傳統(tǒng)藥材已有千年歷史[7]。過去對其有效成分的研究集中在紅景天苷、紅景天素和酪醇上，隨著研究的深入，紅景天多糖因其獨特的生理活性和藥理作用而受到關(guān)注。紅景天多糖為紅景天干燥根及莖的多糖提取物，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、木糖和半乳糖等組成。紅景天多糖作為傳統(tǒng)的中草藥提取物，具有抗衰老、抗氧化以及抗凋亡等多種生物活性。紅景天多糖對小鼠心肌細胞有較強的保護作用，能夠增強血液中的SOD活性[8]，并能增強四氧嘧啶和腎上腺素引起的肝糖原分解[9]，且具有明顯的抗傷害感受作用[10]。在生殖系統(tǒng)保護方面，紅景天多糖能提高豬精子的抗氧化能力，明顯提高豬冷凍精子品質(zhì)[11]。

AP是一種單酯磷酸水解酶，能在堿性條件下水解單酯釋放磷酸，AP通過磷脂酰肌醇聚糖聯(lián)接到細胞膜上定位在細胞表面，未分化細胞的AP表達量很高。作為成體干細胞的一種，SSCs分化程度很低，表現(xiàn)出較高的AP活性。大量研究表明，可借助細胞形態(tài)和AP活性可作為檢驗SSCs的依據(jù)。本試驗結(jié)果表明加入紅景天多糖后SSCs數(shù)量明顯增加，細胞為集落樣生長，并呈現(xiàn)出鏈狀或葡萄串狀生長的特點，AP染色結(jié)果符合SSCs的特征。

Thy-1、GFRa-1是目前體外鑒定SSCs常用的表面標志物，而不存在于Sertoli細胞中，而β-actin是持家基因，在Sertoli細胞和SSCs中均表達。本試驗通過檢測是否表達Thy-1、GFRa-1基因來鑒定細胞是否為SSCs，RT-PCR結(jié)果表明，Thy-1、GFRa-1基因均在所培養(yǎng)的細胞中表達，符合SSCs的基因特征，表明所培養(yǎng)的細胞為SSCs，這與李蓮軍等[12]的研究結(jié)果一致。

Kateri等[13]研究表明，決定干細胞的增殖和分化是由其內(nèi)在調(diào)節(jié)機制和外界與其緊密聯(lián)系的環(huán)境相互作用共同影響。Sertoli細胞作為SSCs的培養(yǎng)層，能夠提供一個與體內(nèi)SSCs增殖分化相類似的微環(huán)境，其分泌產(chǎn)生的GDNF能顯著地促進SSCs的增殖。本試驗中加入紅景天多糖后SSCs增殖明顯，增殖率可達152%。推測紅景天多糖可能在人為構(gòu)建的體外SSCs微環(huán)境中參與了Sertoli細胞對SSCs的免疫調(diào)節(jié)作用。另外，在獲得SSCs的過程中，由于機械力的剪切以及酶處理等作用，而隨后和飼養(yǎng)層細胞的共培養(yǎng)過程中各種成份的相互作用，SSCs可能會受到氧自由基的損傷。張奕等[14]研究證實，紅景天多糖具有較強的清除超氧陰離子自由基(O2-)和抑制脂質(zhì)過氧化作用的能力，推測紅景天多糖對SSCs的促增殖作用可能與其提高抗氧化能力及對機體的免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用相關(guān)，但其對精原干細胞增殖的作用機制以及高濃度對細胞增殖的抑制作用的機理仍待進一步研究探討。而且由于紅景天多糖的組成成份復(fù)雜，究竟是其中某一個組分還是多個組分的相互作用而對精原干細胞的體外增殖產(chǎn)生影響，仍有待進一步的研究。雖然本試驗只是對SSCs的體外培養(yǎng)1周增殖的相關(guān)研究，但是SSCs的量顯著增加，為今后SSCs的研究及應(yīng)用提供新的思路和方法。

4 結(jié) 論

在以Sertoli細胞作為SSCs的培養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中，添加紅景天多糖能顯著增加體外培養(yǎng)的SSCs數(shù)量，且最適添加量為300 ng/mL。培養(yǎng)1周后的細胞為集落樣生長，并呈現(xiàn)出鏈狀或葡萄串狀生長的特點。紅景天多糖能顯著促進以Sertoli細胞作為滋養(yǎng)層的體外培養(yǎng)體系中SSCs增殖，為后續(xù)SSCs的體外培養(yǎng)、研究應(yīng)用提供參考依據(jù)。

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