邢詠梅，李紅蓮，郭順星

活性氧（ROS）存在于所有真核生物正常細(xì)胞代謝過程中，現(xiàn)已明確低濃度非致死性的活性氧可以作為細(xì)胞-信號(hào)通路的調(diào)節(jié)分子，調(diào)節(jié)各種生理過程[1]。作為真核細(xì)胞型微生物的真菌，其分化發(fā)育也與活性氧的產(chǎn)生密切相關(guān)。Egan 等[2]通過研究證實(shí)，真菌細(xì)胞中的活性氧與細(xì)胞的分化直接相關(guān)。植物病原真菌由菌絲形成菌核的機(jī)制一直倍受研究者們的關(guān)注。Georgiou[3]首先提出了真菌菌核的形成及分化與氧化應(yīng)激高度相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)了Sclerotium rolfsii 菌核的形成過程伴隨著高度的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生。在隨后的研究中，植物病原真菌菌核的形成被認(rèn)為是由氧化應(yīng)激觸發(fā)形成的[4]。生物體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧包括：過氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧（）、羥自由基（·OH）、超氧自由基（·）等。藥用真菌豬苓菌絲形成菌核過程中是否伴隨 ROS 的變化以及抗氧化劑對(duì)豬苓菌絲形成菌核的影響值得探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 本實(shí)驗(yàn)所用豬苓采自山西古縣北平鎮(zhèn)黨家山村，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭順星研究員分離鑒定，保存于麥麩瓊脂培養(yǎng)基中。

1.1.2 試劑 麥芽糖、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、維生素 B1、瓊脂粉等購自北京科百奧生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 SP-752 紫外可見光分光光度計(jì)購自上海光譜儀器有限公司；除菌濾器、微孔濾膜（孔徑 0.22 μm，直徑 13 mm）購自北京科百奧生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基由麥芽糖 20.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂粉 15.0 g、去離子水1000 ml 配制而成。培養(yǎng)基在高壓滅菌前，將初始pH 調(diào)至 5.0。

1.2.2 抗氧化劑的添加 將維生素 C（Vc）溶解于去離子水中，配制成 100 mg/ml 的母液，母液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后，將不同體積的 Vc母液分別加入到滅菌后冷卻至 60 ℃ 左右的麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基中，使 Vc 在培養(yǎng)基中的終濃度分別為 0.5、1.0、2.0、5.0、10 和 15 mg/ml。將 NADPH氧化酶抑制劑 apocynin（Apo）溶解于去離子水中并以超聲助溶，配制成 100 mmol/L 的母液，加入至滅菌后冷卻至 60 ℃ 左右的麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基中，使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為 10、20、40 mmol/L。每組 30 個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。以不添加抗氧化劑的組為對(duì)照組，將培養(yǎng)基倒入直徑為 9 cm 的平皿中，每個(gè)平皿倒入 20 ml 培養(yǎng)基。

1.2.3 培養(yǎng)及接種方法 參照文獻(xiàn)[5-6]中培養(yǎng)豬苓的方法進(jìn)行。

1.2.4 觀察豬苓菌絲生長及菌核形成情況 觀察豬苓菌絲在培養(yǎng)過程中的生長情況。培養(yǎng) 60 d，用鑷子和手術(shù)刀片將豬苓菌核取出并稱取豬苓菌核鮮重，以不添加抗氧化劑的組為對(duì)照組，比較各組豬苓菌核形成的生物量情況。

1.2.5 NBT 還原法檢測豬苓菌核形成過程中菌絲及菌核活性氧含量 以不添加 Vc 的組為對(duì)照組，考察豬苓菌絲形成菌核過程中菌絲及菌核的活性氧含量以及抗氧化劑 Vc 對(duì)豬苓菌核發(fā)育過程中活性氧含量的影響。按照文獻(xiàn)[7]中方法進(jìn)行測定，將不同發(fā)育階段的豬苓菌絲或菌核樣本（0.1 g）與 1 ml 磷酸緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.8）充分混合后研磨勻漿（磷酸緩沖液中含有溶質(zhì) 0.1 mmol/L EDTA，0.3% w/v Triton X-100 及 4% w/v PVP聚乙烯吡咯烷酮），4 ℃ 條件下，15000×g 離心20 min 后取上清液 1 ml，加入 2 ml 0.05% 氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）與上清液反應(yīng) 10 min，4 ℃，15000×g，離心 20 min 后取上清液。在 85 ℃ 水浴中孵育 5 min，冷卻至室溫，于波長 580 nm 處測定吸光度，吸光度的值與活性氧的含量成正比。每個(gè)樣品重復(fù) 3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 抗氧化劑對(duì)豬苓菌絲生長和菌核形成的影響

不同濃度 Vc 和 Apo 對(duì)豬苓菌核生物量的影響結(jié)果見表 1。培養(yǎng) 60 d，低濃度（0.5 mg/ml）的Vc 組（Vc-0.5）能夠促進(jìn)豬苓菌絲生長并促使豬苓菌絲形成菌核，豬苓菌絲生長旺盛，氣生菌絲發(fā)達(dá)（圖 1B），其菌核形成的生物量為不添加 Vc 的對(duì)照組的 1.09 倍，兩者之間的差異無顯著性（P ＞0.05）。濃度為 1.0 mg/ml 的 Vc 組(Vc-1)豬苓菌絲生長旺盛，其菌核形成的生物量僅為對(duì)照組的57%（圖 1C）；濃度為 2.0 mg/ml的 Vc 組（Vc-2）豬苓菌絲其菌核形成的生物量僅為對(duì)照組的 29%；濃度為 5.0、10、15 mg/ml Vc 組（Vc-5、Vc-10、Vc-15）對(duì)豬苓菌絲生長具有不同程度的抑制作用，隨著 Vc 濃度的升高，其對(duì)豬苓菌絲生長抑制程度增強(qiáng)，Vc-5 組豬苓菌絲生長較緩慢，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，外圍新生菌絲與接種處周圍生長的菌絲之間有明顯的空隙（圖 1D）；Vc-15 組中的豬苓菌絲呈固縮狀生長，氣生菌絲不發(fā)達(dá)（圖 1F）；Vc-5、Vc-10、Vc-15 組均不能使豬苓菌絲形成菌核。與不添加抗氧化劑的對(duì)照組相比，NADPH 氧化酶抑制劑 Apo（10、20、40 mmol/L）使豬苓菌絲生長明顯減緩，并且不能誘導(dǎo)豬苓菌核形成。

表1 抗氧化劑對(duì)豬苓菌核形成的生物量的影響（）Table1 Effects of antioxidants on P.umbellatus sclerotia biomass ()

表1 抗氧化劑對(duì)豬苓菌核形成的生物量的影響（）Table1 Effects of antioxidants on P.umbellatus sclerotia biomass ()

注：*：P ＞ 0.05；**：P ＜ 0.05。Note: *: P ＞ 0.05; **: P ＜ 0.05.

組別（n = 30）Groups（n = 30）菌核生物量(g/20g 基質(zhì))Biomass of sclertia (g/20 g substrate)Vc-0（對(duì)照） Vc-0 (control) 1.55 ± 0.10 Vc-0.5 1.69 ± 0.06*Vc-1 0.88 ± 0.20**Vc-2 0.45 ± 0.08**Vc-5 0 Vc-10 0 Vc-15 0 Apo（10、20、40 mmol/L） 0

2.2 NBT 還原法檢測豬苓菌核形成過程中活性氧含量

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，在培養(yǎng)的不同時(shí)相，以不添加 Vc 的 Vc-0 組豬苓菌絲內(nèi) ROS含量為最高，其次是 Vc-0.5 組，隨著 Vc 濃度的升高，豬苓菌絲內(nèi) ROS 含量逐漸降低。各組從培養(yǎng)的 15 ～45 d，豬苓菌絲內(nèi) ROS 含量呈逐漸增高的趨勢；當(dāng)培養(yǎng) 45 d 時(shí)，豬苓菌絲內(nèi) ROS 含量達(dá)到最高，此時(shí)，Vc-0 組豬苓菌絲內(nèi) ROS 含量僅為 Vc-0.5組的 1.091 倍；Vc-0 組豬苓菌絲內(nèi) ROS 含量為Vc-1 組的 1.315 倍，為 Vc-2 組的 1.757 倍，為Vc-5 組豬苓菌絲內(nèi) ROS 含量的 2.76 倍，說明高濃度的 Vc 在很大程度上消除了活性氧，而添加了低濃度的 Vc 組（0.5 mg/ml）對(duì)活性氧的清除作用并不明顯；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，豬苓菌絲內(nèi) ROS含量出現(xiàn)降低的趨勢并逐漸保持平穩(wěn)，結(jié)果見圖 2。

圖1 培養(yǎng) 60 d，抗氧化劑 Vc 對(duì)豬苓菌核形成的影響[A：未添加 Vc 的 Vc-0 組（對(duì)照組）；B：Vc-0.5 組；C：Vc-1 組；D：Vc-5 組；E：Vc-10 組；F：Vc-15 組]Figure1 Effect of antioxidants on P.umbellatus sclerotial formation after cultivation for 60 days (A: Control group without Vc; B:Vc-0.5 group with 0.5 mg/ml vitamin C; C: Vc-1 group with 1 mg/ml vitamin C; D: Vc-5 group with 5 mg/ml vitamin C; E: Vc-10 group with 10 mg/ml vitamin C; F: Vc-15 group with 15 mg/ml vitamin C)

圖2 抗氧化劑 Vc 對(duì)豬苓菌絲形成菌核過程中活性氧含量的影響Figure2 Effects of antioxidants on ROS content during sclerotial formation directly from mycelia

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，植物病原菌 S.rolfsii 菌核形成和分化過程中伴隨著高水平的氧化應(yīng)激[3]；抗氧化劑的應(yīng)用能夠抑制 S.rolfsii、Rhizoctonia solani、Sclerotinia minor 以及 Sclerotinia sclerotiorum 菌核的形成和分化[8-9]。生物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與抗氧化防御功能之間的平衡發(fā)生紊亂造成了氧化應(yīng)激狀態(tài)的形成[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的 Vc（0.5 mg/ml）能夠促進(jìn)豬苓菌絲生長并促使豬苓菌絲形成菌核；雖然低濃度的 Vc 能夠部分的抵消豬苓菌絲及菌核活性氧的含量，但與不添加 Vc 的對(duì)照組相比，兩組中的豬苓菌絲的活性氧含量十分接近，說明兩組中菌絲內(nèi)的氧化應(yīng)激水平接近，因此，對(duì)豬苓菌核形成的生物量無顯著性差異。隨著 Vc 濃度的增加，豬苓菌絲內(nèi)活性氧的含量逐漸下降，當(dāng) Vc 濃度為5.0、10、15 mg/ml 時(shí)，豬苓菌絲不能形成菌核，可能與豬苓菌絲內(nèi)的活性氧的含量過低，導(dǎo)致菌絲內(nèi)的氧化應(yīng)激水平過低有關(guān)。因此，豬苓菌絲形成菌核過程中伴隨活性氧的迸發(fā)，豬苓菌絲內(nèi)氧化應(yīng)激達(dá)到一定的水平時(shí)才可能促使豬苓菌絲向菌核分化。然而，豬苓菌絲形成菌核的過程是一個(gè)復(fù)雜的多因素綜合作用的結(jié)果，各種理化因子及生物調(diào)控因子共同參與其中，有關(guān)豬苓菌絲形成菌核的分子生物學(xué)機(jī)制的研究正在進(jìn)一步的探討中。我們期待在以后的研究中有新的發(fā)現(xiàn)，為深入探討豬苓菌絲形成菌核機(jī)制的研究提供重要的理論基礎(chǔ)。

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