沈穎穎，邵 爽

(浙江外國(guó)語(yǔ)學(xué)院科學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州310012)

蛋白質(zhì)-表面活性劑混合體系廣泛應(yīng)用于藥物、化妝品、生物及食品等領(lǐng)域［1-2］.表面活性劑與蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用的研究一直是人們十分感興趣的課題［3-8］，其主要包括表面活性劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化以及相互作用機(jī)制;表面活性劑結(jié)構(gòu)、濃度、溶劑、pH值、離子強(qiáng)度和溫度等因素對(duì)相互作用的影響等.

離子強(qiáng)度對(duì)小分子與生物大分子相互作用存在一定影響.陽(yáng)離子表面活性劑與血清蛋白通過(guò)靜電引力和疏水方式作用，且靜電作用占主導(dǎo)地位，離子強(qiáng)度的變化會(huì)直接影響二者作用［9］.離子強(qiáng)度的變化對(duì)牛血清蛋白的平衡吸附容量有很大的影響［10］，此外離子強(qiáng)度對(duì)BSA的熒光強(qiáng)度影響顯著［11］.

本文在已有研究工作［12-14］的基礎(chǔ)上，通過(guò)改變NaCl濃度改變體系的離子強(qiáng)度，用熒光光譜法考察離子強(qiáng)度對(duì)新型季銨鹽類離子型表面活性劑N-十四烷基-N-羥乙基-N，N-二甲基溴化銨(THDAB)與牛血清白蛋白(BSA)相互作用的影響，運(yùn)用理論模型處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、平均結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等重要相互作用參數(shù)，從而進(jìn)一步闡明表面活性劑與BSA的結(jié)合機(jī)制及作用規(guī)律.

1 儀器和試劑

1.1 儀器

FP-6200型熒光分光光度計(jì)(日本Jasco公司);Finnpipette移液器(上海雷勃分析儀器有限公司)5～50μL，20～200 μL;TB-85型超級(jí)恒溫器(日本Shimadzu公司);UPWS-10T超純水器(杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司);AB265-S電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司).

1.2 試劑及配制

BSA購(gòu)于上海伯奧生物科技有限公司，氮含量≥13.5%;N-十四烷基-N-羥乙基-N，N-二甲基溴化銨(THDAB)為浙江大學(xué)化學(xué)系提供(純度≥99.9%);三羥基氨基甲烷(Tris)(純度≥99.9%)、HCl(濃度為36%～38%)、NaCl(含量≥99.5%)，三者均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

配制 pH=7.1 的 Tris-HCl緩沖溶液(分別含0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mol·L－1的 NaCl以改變離子強(qiáng)度)，分別用上述不同離子強(qiáng)度的 Tris-HCl緩沖溶液配制4.0μmol·L－1BSA 溶液及1.0×10－3mol·L－1THDAB溶液備用.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

BSA熒光激發(fā)和發(fā)射光譜測(cè)定:用移液器移取一定濃度BSA溶液于石英比色皿中，設(shè)置發(fā)射波長(zhǎng)為280nm，狹縫寬度為5nm，在298K下掃描250～350 nm的熒光激發(fā)光譜，測(cè)得其最大激發(fā)波長(zhǎng);并在其最大激發(fā)波長(zhǎng)處，同樣條件下掃描其290～410nm的熒光發(fā)射光譜，得到最大發(fā)射波長(zhǎng).

THDAB對(duì)BSA的熒光猝滅光譜:分別移取含不同NaCl濃度的BSA溶液與不同濃度的THDAB溶液于容量瓶中，混均、恒溫至298K，設(shè)置熒光激發(fā)和發(fā)射最大寬度均為5nm，最大激發(fā)波長(zhǎng)為282nm，測(cè)定其熒光發(fā)射光譜，記錄最大熒光強(qiáng)度.

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜

分子中色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)等氨基酸殘基可吸收270～300nm紫外光產(chǎn)生熒光，從而成為內(nèi)源性熒光物質(zhì).BSA的內(nèi)源熒光主要由Trp產(chǎn)生，其熒光最大激發(fā)波長(zhǎng)在282nm附近.實(shí)驗(yàn)測(cè)得4μmol·L－1BSA的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜示于圖1，得到BSA的最大激發(fā)波長(zhǎng)為282nm，在此激發(fā)波長(zhǎng)下其發(fā)射光譜的最大波長(zhǎng)為345nm.

圖1 BSA的激發(fā)和發(fā)射光譜

2.2 猝滅光譜

當(dāng)NaCl濃度為0.2mol·L－1時(shí)，THDAB-BSA的熒光猝滅光譜見(jiàn)圖2，其它不同NaCl濃度的猝滅光譜圖類似.結(jié)果表明，隨著加入的表面活性劑量增加，BSA發(fā)射光譜的熒光強(qiáng)度減小，產(chǎn)生熒光猝滅.

2.3 Stern-Volmer猝滅常數(shù)及猝滅機(jī)制

對(duì)于低濃度區(qū)，表面活性劑對(duì)BSA熒光猝滅效應(yīng)基本符合Stern-Volmer方程［15］:

式中I0為未加入猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，I為猝滅劑濃度等于［D］時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度;Kq為雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù);τ0為沒(méi)有猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命(生物大分子的τ0約為10-8s)，Ksv稱為 Stern-Volmer猝滅常數(shù).

圖2 THDAB濃度對(duì)BSA的熒光強(qiáng)度的影響

在THDAB濃度低于100μmol·L－1范圍內(nèi)，以最大發(fā)射波長(zhǎng)345nm處BSA熒光強(qiáng)度按式(1)將I0/I對(duì)［NaCl］進(jìn)行線性回歸，得到溫度為298K時(shí)THDAB-BSA體系的Stern-Volmer方程式猝滅常數(shù)Ksv和相應(yīng)線性相關(guān)系數(shù)R2，結(jié)果列于表1.

表1 THDAB-BSA 體系的猝滅常數(shù) Ksv及線性相關(guān)系數(shù) R2(T=298K，pH=7.1，［BSA］=4μmol·L－1)

由表1可知，在THDAB-BSA體系中，隨著NaCl濃度的增大，其Stern-Volmer猝滅常數(shù)Ksv增大;雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)Kq均大于生物分子的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)(2.0×1010L·mol－1·s－1)，這說(shuō)明THDAB對(duì)BSA的熒光猝滅機(jī)制呈現(xiàn)靜態(tài)猝滅特征.

2.4 結(jié)合常數(shù)及離子強(qiáng)度對(duì)結(jié)合常數(shù)的影響

小分子對(duì)蛋白質(zhì)熒光的靜態(tài)猝滅可用位點(diǎn)模型來(lái)處理［16］:

式中I，I0分別是有和無(wú)猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度，KA是BSA與猝滅劑之間的結(jié)合常數(shù)，［D］是猝滅劑的平衡濃度，n是結(jié)合位點(diǎn)數(shù).由此方程以log［(I0－I)/I］對(duì)log［D］作圖，由直線斜率求得不同溫度下猝滅劑與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，通過(guò)截距可以求出結(jié)合常數(shù)KA值.

將本實(shí)驗(yàn)得到的猝滅光譜數(shù)據(jù)，按式(2)進(jìn)行線性回歸，得到不同NaCl濃度下THDAD與BSA結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及相關(guān)系數(shù)R2(見(jiàn)表2).

表2 THDAB與BSA結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)KA、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n及相關(guān)系數(shù)R2(T=298K pH=7.1)

為了便于分析離子強(qiáng)度對(duì)THDAB與BSA結(jié)合作用的影響，將不同NaCl濃度下THDAB對(duì)BSA的熒光猝滅強(qiáng)度與［NaCl］作圖(見(jiàn)圖3)，同時(shí)將按上述模型擬合得到的KA與［NaCl］關(guān)系作圖(見(jiàn)圖4).

圖3 不同［NaCl］時(shí)THDAB-BSA的猝滅光譜

圖4 結(jié)合常數(shù)KA與NaCl濃度關(guān)系

結(jié)果表明，離子強(qiáng)度對(duì)THDAB與BSA結(jié)合作用有較大影響，主要表現(xiàn)在離子強(qiáng)度的增加導(dǎo)致:(1)THDAB對(duì)BSA的熒光猝滅強(qiáng)度減小(見(jiàn)圖3);(2)THDAB與BSA的結(jié)合作用減小、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)下降(見(jiàn)圖4).產(chǎn)生這一結(jié)果的主要原因可歸結(jié)為以下兩個(gè)方面:隨著離子強(qiáng)度增加，鹽離子強(qiáng)烈地屏蔽蛋白質(zhì)分子和結(jié)合分子之間的靜電引力，使BSA分子難以在介質(zhì)表面上吸附和重排，表現(xiàn)為結(jié)合能力減弱［17］;NaCl的加入，造成較高的離子氛，降低了兩者的親和力［18］.本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致.

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