楊萬政 蒲維維 白音夫

(1.中央民族大學生命與環(huán)境科學學院，北京 100081 2.中國氣象局北京城市氣象研究所，北京 100089 3.內蒙古自治區(qū)中蒙醫(yī)研究所，內蒙古 呼和浩特 010020)

蒙藥沙棘清喉顆粒由金銀花、牛蒡子、玄參、沙棘等7味中藥組成，具有清透熱邪、利咽散結之功效。根據(jù)處方藥味性質及藥理作用的研究，本文選用綠原酸、牛蒡子苷和總黃酮作為評價指標，對清喉顆粒的提取工藝進行正交優(yōu)化試驗。藥理實驗表明，綠原酸具有利膽保肝、抗菌、抗病毒、降壓、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理作用［1－3］;牛蒡子苷具有鈣拮抗樣作用，能抗腎炎，改善血清生化指標和抗腫瘤作用以及擴張血管等作用［4］;沙棘總黃酮(THF)能增強小鼠特異和非特異免疫功能，提高耐缺氧能力、降低血清膽固醇、抑制血小板聚集、抗?jié)?、抗炎、抗過敏、抗氧化、抗衰老、抗輻射和抗菌、抗病毒及增強免疫等廣泛的藥理功效［5］。

本文采用L9(34)正交實驗對沙棘清喉顆粒的制備工藝條件進行優(yōu)選，同時由于正交表中各列因素水平均已排滿，不需使用更大的正交表。故作重復試驗，估算試驗誤差，進行方差分析，以此確定各因素的顯著性水平。從而得出清喉顆粒的最佳工藝參數(shù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器:LC10－ADvp型高效液相色譜儀;V－550紫外可見分光光度計;Millipore純水機;Adventurer電子分析天平。

1.2 藥材:金銀花、薄荷、牛蒡子、玄參、蘆根購于北京同仁堂藥店;沙棘購于水利部高原圣果有限公司;余甘子購于西藏藥廠。

1.3 標準品:綠原酸標準品(批號110753－200413)、牛蒡子苷標準品(批號110819－200404)、蘆丁標準品(100080－200306)購于中國藥品生物制品檢定所。

1.4 試劑:甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 提取工藝篩選:按處方比例，稱取各藥味，加溶劑浸泡，提取工藝篩選得到樣品溶液。以L9(34)正交表安排實驗?？疾煲蛩匾姳?。

綜合評分:因金銀花為方中君藥，綠原酸為金銀花的主要有效成分，具有較高的藥理活性，故綠原酸為重要指標之一，權重系數(shù)定為0.4。牛蒡子苷為牛蒡子的有效成分，且牛蒡子為方中臣藥，因此，牛蒡子苷作為評價提取工藝的一個指標，權重系數(shù)定為0.3。作為大類成分間接控制的一個指標，總黃酮的權重系數(shù)定為0.3。

表1 因素與水平

2.2 含量測定

2.2.1 綠原酸的含量測定:色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;檢測波長327nm;流動相乙腈－水(20:80)，磷酸調節(jié)pH=4;流速1mL/min;柱溫30℃。

分別準確移取濃度為8.5μg·mL－1的綠原酸對照品溶液0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL 于 10mL 容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，各取20μL稀釋液進樣，在上述色譜條件下測定峰面積。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，直線回歸得標準曲線方程為:y=54645x－122210，R2=0.9997。結果表明綠原酸進樣濃度在8.5～68μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

取樣品溶液1mL，用50%甲醇定容至10mL，過微孔濾膜，所得濾液為供試品溶液。在上述色譜條件下，取20μl進樣測定峰面積。由標準曲線方程計算樣品溶液中綠原酸的含量。

2.2.2 牛蒡子苷的含量測定:色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;流動相乙腈－水(30:70);流速1mL/min;檢測波長278nm;柱溫30℃。

分別準確移取濃度為 8.7μg·mL－1對照品溶液 0.25mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL 于 10mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，各取20μL稀釋液進樣，在上述色譜條件下測定峰面積。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，直線回歸得標準曲線方程為:y=11918x－2845.6，R2=0.9996。結果表明牛蒡子苷進樣濃度在2.175～69.600μg·mL－1范圍內與峰面積線性關系良好。

取樣品溶液1mL，用甲醇定容至10mL，過微孔濾膜，所得濾液為供試品溶液。在上述色譜條件下，取20μL進樣測定峰面積。由標準曲線方程計算樣品溶液中牛蒡子苷的含量。

2.2.3 總黃酮的含量測定:精確稱取6.1mg蘆丁標準品，用甲醇溶解，定容到250mL容量瓶中，備用。分別準確移取以上述對照品溶液 5mL、7mL、9mL、11mL、13mL、15mL 于25mL容量瓶中，加5%AlCl3甲醇溶液1mL，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，靜置10min。

以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標，直線回歸得標準曲線方程為:y=0.0522x+0.0275，R2=0.9999。結果表明總黃酮濃度在 4.880 ～14.640μg·mL－1范圍內與吸光度線性關系良好。

取1mL樣品溶液于25mL容量瓶中，加入1mL5%AlCl3甲醇溶液，再加入甲醇定容，靜置10min，進行測定，以標準曲線方程計算樣品含量。

2.3 正交實驗結果:根據(jù)以上正交因素的因素－水平表，按四因素三水平正交實驗進行9次實驗，正交實驗安排和結果見表2。

表2 L9(34)正交實驗結果

表3 方差分析

2.3.2 結果分析:為避免實驗誤差的干擾，對正交實驗結果進行了極差分析。結果見表。因為極差R的大小顯示影響因素的主次，由R值大小可見，不同因素對有效成分提取量的影響程度不同，表2表明影響因素順序為D(提取次數(shù))＞A(乙醇濃度)＞C(提取時間)＞B(料液比)。

提取次數(shù)對有效成分得率影響最大，提取次數(shù)為3次時提取效果最好;提取時間的影響次之，提取時間為1.5h時，有效成分得率最高;乙醇濃度則以70%為最佳;料液比對提取的影響最小，從極差分析可以看出，料液比達到1:10，有效成分得率較其它條件時要高。所以在生產時可以采用 A2B2C2D3，即工藝條件為:70%乙醇、浸泡 2h、1:10、1.5h/次，共提取3次。

2.4 重復驗證試驗:為進一步考察上述優(yōu)選工藝條件的穩(wěn)定性，按最佳工藝條件A2B2C2D3進行重復2次提取，對最佳提取工藝進行驗證。實驗結果見表4。綠原酸、總黃酮和牛蒡子苷得率的RSD值均小于3%，從而說明該工藝合理可行。

表4 提取工藝驗證試驗數(shù)據(jù)

3 結論

復方提取工藝考察了醇濃度、料液比、提取時間和提取次數(shù)等因素，選取了有顯著影響的因素進行正交實驗，實驗結果表明，影響程度為:提取次數(shù)＞乙醇濃度＞提取時間＞料液比。

最佳復方提取工藝為:藥材飲片先粉碎成粗粉，加入10倍量70%乙醇進行提取，每次提取1.5h，共提取3次。在該條件下各指標含量較高，說明藥材提取利用較完全，并經(jīng)重復試驗驗證，該工藝穩(wěn)定可行。

［1］劉軍海，裘愛泳.杜仲葉綠原酸提取純化工藝的研究［J］.中藥材，2004，12

［2］陰鍵編.中藥現(xiàn)代研究與臨床應用(2)［M］.北京:中醫(yī)古籍出版社，1995:66

［3］Abraham S K，Sarma L，Kesavan P C.Protective effects of chlorogenic acid，curumin and a a－carotene against r－radiation － induced in vivo chromosomal damage［J］.Mutation Research，1993，303:109 ～112

［4］王本祥.現(xiàn)代中藥藥理與臨床［M］.天津:天津科技翻譯出版社，2004

［5］黃朗，劉常伍，范維衡等.醋柳總黃酮防治冠心病藥理基礎研究［J］.華西藥學雜志，1986，1(3):163～167