陶慧林，黎舒懷，徐銘澤，周素蓮，劉帥濤，易忠勝

(桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541004)

隨著光譜技術(shù)的不斷發(fā)展，以靈敏度高、信號穩(wěn)定為特征的熒光光譜法已成為研究藥物及其他小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的重要手段［1－3］。山奈素(Kaempferide，KF)化學(xué)名為4-甲氧基-3，5，7-三羥基黃酮(見圖1)，是一種廣泛分布在高等植物中的黃酮類化合物，具有祛痰、防治咳嗽和哮喘、降低血壓、降血脂、抗動脈硬化等多種生物功能［4］。在腫瘤臨床治療的應(yīng)用上，KF與化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用可起到協(xié)同增效的抗腫瘤作用，可望成為有效的抗癌防癌的治療及保健制劑［5］。目前對于KF與牛血清蛋白(BSA)相互作用的研究主要集中在單純的熒光光譜法和紫外可見吸收光譜法［6－7］，得到的信息有限，不能滿足進一步研究的需要。

本實驗利用熒光光譜和紫外可見吸收光譜法，首次采用Tachiya模型與Stern－Volmer方程比較研究了生理條件下KF與BSA之間的相互作用，對二者相互作用的模式、作用力類型以及熱力學(xué)性質(zhì)等方面作出闡釋。為闡明藥物與白蛋白的作用機制，了解藥物在生命體內(nèi)的存儲和運輸情況，進一步研究天然黃酮類化合物在生物體內(nèi)的作用提供了重要信息。

圖1 山奈素的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecular structure of kaempferide

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301PC熒光光度計(日本島津);Carry-50型紫外－可見吸收光譜分光光度計(美國瓦里安);EL204電子分析天平;PT-10便攜式pH計。

山奈素(生化試劑，99.0%):用無水乙醇配制成3.494×10－3mol/L儲備溶液，使用時移取適量儲備溶液，用二次水稀釋至1.0×10－4mol·L－1;牛血清白蛋白(BSA，國藥集團化學(xué)試劑有限公司):用 pH 7.4 的 Tris－HCl緩沖溶液(含 0.10 mol·L－1NaCl以維持離子強度)配制 1.0 ×10－5mol·L－1的BSA儲備溶液，于4℃以下保存?zhèn)溆?。其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗方法

在10 mL比色管中準(zhǔn)確移入1.00 mL 1.0×10－5mol·L－1BSA溶液，用微量注射器依次加入不同量的KF溶液，用pH 7.4的Tris－HCl緩沖溶液定容至10 mL。在設(shè)定溫度(298、304、310 K)下于恒溫水浴中靜置5 min。設(shè)定激發(fā)光柵和發(fā)射光柵的狹縫寬度為3.0 nm/5.0 nm，激發(fā)波長為280 nm，恒溫掃描BSA在290～500 nm的熒光發(fā)射光譜。分別固定Δλ=15 nm及Δλ=60 nm，記錄KF與BSA混合溶液的同步熒光光譜。測定物質(zhì)的量濃度比為1∶1的KF與BSA溶液的紫外吸收光譜及熒光發(fā)射光譜。

圖2 298 K時KF對BSA的熒光猝滅圖Fig.2 Fluorescence quenching spectra of BSA in the presence of KF at 298 K

2 結(jié)果與討論

2.1 應(yīng)用Stern－Volmer方程研究KF與BSA相互作用

2.1.1 KF對BSA的熒光猝滅光譜 將BSA的濃度固定，逐漸增大KF溶液的濃度，熒光猝滅圖如圖2所示。BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基使其具有內(nèi)源性熒光，在348 nm處有最大熒光峰。隨著KF濃度的增加，BSA的熒光強度明顯降低，這表明KF和BSA之間發(fā)生了結(jié)合作用。此外，BSA的最大發(fā)射波長出現(xiàn)藍(lán)移，表明隨著KF濃度的增大BSA發(fā)色團的疏水環(huán)境發(fā)生了改變。

2.1.2 KF對BSA熒光猝滅機理及猝滅常數(shù)的確定

通過Stern－Volmer方程［8］分析熒光猝滅數(shù)據(jù):

式中:Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)，KSV為動態(tài)猝滅常數(shù)，τ0為無猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命，生物大分子的熒光壽命約為10－8s，F(xiàn)0和F分別為未加入和加入KF時BSA的熒光強度，［Q］為猝滅劑KF的濃度。KF和BSA之間相互作用的Stern－Volmer猝滅常數(shù)KSV及相關(guān)系數(shù)r計算結(jié)果見表1。

表1 不同溫度下KF與BSA相互作用的Stern－Volmer猝滅常數(shù)Table 1 Stern－Volmer constant of interaction between KF and BSA at different temperatures

圖3 不同溫度下KF對BSA熒光猝滅的雙對數(shù)曲線Fig.3 The double logarithmic curves for the quenching of BSA fluorescence by KF at different temperatures

對于動態(tài)猝滅，各類猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)約為 2 ×1010L·mol－1·s－1［9］。此外，動態(tài)和靜態(tài)猝滅可根據(jù)猝滅常數(shù)KSV隨溫度的變化關(guān)系加以判斷。對于靜態(tài)猝滅，KSV值隨著溫度升高而降低，而對于動態(tài)猝滅，溫度的升高將增加有效碰撞和加劇電子轉(zhuǎn)移過程，使熒光猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大［10］。結(jié)果表明該反應(yīng)的 Kq值大于2.0×1010L·mol－1·s－1，且 KSV的值隨著溫度升高而降低，表明猝滅是靜態(tài)猝滅，反應(yīng)形成了BSA－KF基態(tài)復(fù)合體。

2.1.3 結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點數(shù) 當(dāng)小分子與大分子結(jié)合時，其結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點數(shù)可從下式獲得［11］:

式中n為結(jié)合位點數(shù)，Ka為表觀結(jié)合常數(shù)，由上式作lg(F0/F－1)～lg［Q］圖(見圖3)。圖中直線的斜率即結(jié)合位點數(shù)n，截距即lgKa，依直線的斜率和截距即可求出KF與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka及結(jié)合位點數(shù)n(見表2)。結(jié)果表明，KF和BSA之間存在強大的結(jié)合力，并且結(jié)合常數(shù)Ka隨著溫度升高而增大，這表明升高溫度后KF與BSA的結(jié)合能力增強，從而導(dǎo)致BSA－KF復(fù)合體的穩(wěn)定性增大。n值接近于1，表明KF與BSA具有一個結(jié)合位點。

表2 通過Stern－Volmer方程得到的KF與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)Table 2 Binding parameters obtained from the interaction of KF with BSA by Stern－Volmer equation

2.1.4 熒光給體－受體間距離的求取 根據(jù)F rster偶極－偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移理論［12］，發(fā)生能量轉(zhuǎn)移時，非輻射能量轉(zhuǎn)移效率E、供能體與受體之間的結(jié)合距離r及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0之間有下列關(guān)系:

式中K2=2/3;R0是E=50%時的臨界距離;N為介質(zhì)折射常數(shù)，取水和有機物折射指數(shù)的平均值1.336;Φ為血清白蛋白的熒光量子產(chǎn)率，通常取蛋白質(zhì)中色氨酸的量子產(chǎn)率0.15［13］;J為給體熒光發(fā)射光譜與受體吸收光譜的重疊積分。圖4為298 K(A)、304 K(B)、310 K(C)溫度下，BSA的熒光光譜與KF的紫外吸收光譜的重疊圖譜。

圖4 BSA熒光光譜與KF吸收光譜的重疊圖Fig.4 Overlap spectra of BSA's fluorescence emission spectra(1)and kaempferide's UV absorption spectra(2)temperature(A－C):298，304，310 K;cBSA=cKF=1.0×10－5mol·L－1

由式(3)～(6)分別求得不同溫度下的能量轉(zhuǎn)移效率E、KF在BSA上的結(jié)合位點以及蛋白質(zhì)分子中的214位色氨酸殘基的距離r，結(jié)果如表3所示。由結(jié)果可知，KF在BSA上的結(jié)合位點與蛋白質(zhì)分子中的色氨酸殘基Trp 214的距離r＜7 nm，具備了能量轉(zhuǎn)移猝滅蛋白質(zhì)熒光的條件，因此非輻射能量轉(zhuǎn)移也是引起熒光猝滅的原因之一。另外，在溫度為298、304 K時，由于結(jié)合距離r小于能量轉(zhuǎn)移效率為50%時的臨界距離R0，說明非輻射能量轉(zhuǎn)移引起蛋白質(zhì)熒光峰猝滅的幾率比靜態(tài)猝滅大，因此非輻射能量轉(zhuǎn)移是KF引起B(yǎng)SA熒光猝滅的主要原因。隨著溫度升高，能量轉(zhuǎn)移效率為50%時的臨界距離R0與結(jié)合距離r均逐漸增大，并在310 K時，能量轉(zhuǎn)移效率為50%時的臨界距離R0約等于藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合距離，因此推測人體生理溫度下，非輻射能量轉(zhuǎn)移與靜態(tài)猝滅共同導(dǎo)致了BSA的熒光猝滅。

表3 BSA熒光光譜與KF吸收光譜重疊積分J與結(jié)合距離rTable 3 The overlap integral and binding distances between fluorescence spectra of BSA and absorption spectra of KF

2.2 利用Tachiya模型研究山奈素與蛋白質(zhì)相互作用

2.2.1 Tachiya模型［14－15］分子與蛋白質(zhì)之間的吸附與解吸可用下式表示:

式中，Qaq表示猝滅劑分子，Bn表示帶n個猝滅劑的BSA。如果BSA中結(jié)合位點為m，假設(shè)式(7)中的速率常數(shù)是合理的:

式中，nav是生物分子中結(jié)合的猝滅劑的平均數(shù)目，可以通過下式計算得到nav:

在式(12)和式(13)中消去［Qaq］，可以得到:

從BSA到猝滅劑的F rster能量轉(zhuǎn)移速率常數(shù)為:

τ0為沒有猝滅劑存在時BSA的熒光壽命，r是BSA與猝滅劑之間的距離，R0是F rster非輻射能量轉(zhuǎn)移距離。如果生物分子在與BSA有相同距離r處有n個結(jié)合的猝滅位點，熒光強度會變?yōu)?

在有無猝滅劑存在的情況下，二者猝滅強度的比值為:

nav可由式(14)求出。通過實驗可以獲知［M］、［Q］和F/F0的值，結(jié)合式(17)和(14)，可以計算出未知變量m、K和r的值，它們均由方程(17)所擬合出的F/F0～［Q］＆［M］曲線所決定。對固定的［M］值，F(xiàn)/F0會隨［Q］值增大而減小。然而［Q］值足夠大時，F(xiàn)/F0會飽和。因為當(dāng)所有BSA的結(jié)合位點都被猝滅劑占去后，繼續(xù)增大［Q］不再使結(jié)合的猝滅劑數(shù)目增加。飽和時猝滅劑結(jié)合的數(shù)目如下:

因此飽和時的熒光強可以表示為:

另外，［Q］足夠小時生物的平均猝滅結(jié)合數(shù)目也很小，可結(jié)合式(14)計算得到:

情況 3.2 {1,2,3}不是X中頂點色集合,以下僅考慮31≤n≤34時的情況,此時C中至多有3個集合不是X和Y中頂點色集合。

此種情況下猝滅結(jié)合數(shù)目的分布約等于:

從而得出熒光強度為:

此處nav可由式(20)得到。

2.2.2 結(jié)合常數(shù)與結(jié)合距離的求取 通過式(22)可知，當(dāng)［Q］足夠低時，F(xiàn)/F0與［Q］成比例，且比例系數(shù)由K、r和［M］決定。因此K、r的值可以由測量兩個不同［M］值時的F/F0～［Q］曲線來確定。不同溫度下的F/F0～［Q］曲線如圖5所示。

圖5 不同溫度時的F/F0～KF濃度關(guān)系圖Fig.5 Curves of F/F0versus concentration of KF obtained by the Tachiya model at different temperatures A.298 K，B.304 K，C.310 K;cBSA: .10 μmol·L －1， .5 μmol·L －1

由式(22)可得BSA與KF相互作用的結(jié)合常數(shù)K如表4所示，結(jié)合常數(shù)K隨溫度的增加而增大，這種趨勢與Stern－Volme方程得到的結(jié)果一致。但由Stern－Volme方程得到的結(jié)合位點數(shù)幾乎不隨溫度變化而變化，而由Tachiya模型得到的實際結(jié)合位點數(shù)卻隨溫度的變化而變化很大。這主要是由于Tachiya模型將結(jié)合位點數(shù)m與分子實際結(jié)合位點數(shù)n進行了區(qū)別考慮，而Stern－Volmer方程是假定結(jié)合位點數(shù)即是藥物分子實際結(jié)合在蛋白質(zhì)上的數(shù)量，這可能并不符合實際情況。Tachiya模型得到的結(jié)果更符合小分子與生物大分子相互作用的實際情況。

表4 通過Tachiya模型得到KF－BSA相互作用的結(jié)合參數(shù)Table 4 The binding parameters of KF－BSA system by Tachiya model

另外，由Tachiya模型得到的結(jié)合距離r與Stern－Volmer方程計算的結(jié)果亦有較大區(qū)別。但兩種方法計算出的結(jié)合距離r均在2～7 nm范圍內(nèi)，表明由藥物向BSA發(fā)生能量轉(zhuǎn)移的幾率較大，具備了能量轉(zhuǎn)移猝滅蛋白質(zhì)熒光的條件，因此非輻射能量轉(zhuǎn)移是引起熒光猝滅的原因之一。

2.2.3 熱力學(xué)參數(shù)及作用力類型的求取 小分子和生物大分子之間的相互作用力包括氫鍵、靜電作用、范德華力、疏水力4種［16］。假設(shè)在測定溫度范圍內(nèi)焓變變化不大，則焓變和熵變ΔS可以從Van t Hoff方程求得:

K近似于在相應(yīng)溫度下Stern－Volmer方程中相互作用體系的結(jié)合常數(shù)Ka，通過lnK對1/T作圖可以得到方程式:lnK=－21 635/T+84.870，r=0.998 6。根據(jù)該公式計算得到ΔH和ΔS，再由ΔG=－RTlnK計算ΔG，結(jié)果如表5所示。

Ross等［16］根據(jù)大量的實驗結(jié)果，總結(jié)出生物大分子與有機小分子等結(jié)合力性質(zhì)與結(jié)合作用熱力學(xué)函數(shù)之間的關(guān)系，根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變ΔH和熵變ΔS的相對大小，可以判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型:ΔH＞0，ΔS＞0為疏水作用力;ΔH＜0，ΔS＜0為氫鍵和范德華力;ΔH≈0，ΔS＞0為靜電引力。由表5可知，該反應(yīng)是自發(fā)反應(yīng)(ΔG ＜0);ΔH＞0，ΔS＞0，說明KF與BSA之間的作用力為疏水作用力。

表5 KF－BSA相互作用的熱力學(xué)常數(shù)Table 5 The thermodynamic parameters of KF－BSA interaction

2.3 KF對BSA構(gòu)象的影響

蛋白質(zhì)的同步熒光光譜常被用來判斷蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。對于蛋白質(zhì)的同步熒光光譜，Δλ=15 nm時只表現(xiàn)出酪氨酸殘基的熒光，Δλ=60 nm時僅表現(xiàn)出色氨酸殘基的熒光。因為氨基酸殘基的最大熒光與其所處環(huán)境的疏水性有關(guān)，所以由熒光波長的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化［17］。本實驗固定激發(fā)波長和發(fā)射波長的間距為Δλ，同步掃描KF與BSA體系的同步掃描光譜以考察BSA的構(gòu)象變化(圖6)。

圖6 KF與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of interaction of KF with BSA A.Δλ =15 nm，B.Δλ =60 nm;cBSA=1.0×10－6mol·L－1;cKF=0.0－3.0(×10－6mol·L－1)

由圖6可觀察到，固定蛋白質(zhì)濃度，隨著KF濃度的增加，BSA分子中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光均被猝滅。KF使BSA的酪氨酸特征熒光峰發(fā)生了微弱的紅移，表明該殘基所處環(huán)境的疏水性減弱;色氨酸特征熒光峰發(fā)生了微弱的紫移，表明該殘基所處環(huán)境的疏水性有所增加，蛋白質(zhì)變得緊密［18］。KF的加入使BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化，推測KF與BSA的相互作用可能是通過與色氨酸殘基的結(jié)合而實現(xiàn)的。

3 結(jié)論

利用熒光光譜與紫外可見吸收光譜研究了不同溫度下，KF與BSA之間的相互作用。使用Tachiya模型與Stern－Volmer方程，探討了兩種不同數(shù)學(xué)模型對相互作用體系計算結(jié)果的影響。結(jié)果表明，使用Tachiya模型時，結(jié)合常數(shù)Ka隨溫度的增加而增大，這種趨勢與Stern－Volmer方程得到的表觀結(jié)合常數(shù)的變化趨勢一致。但由Stern－Volmer方程得到的結(jié)合位點數(shù)幾乎不隨著溫度變化而變化，而由Tachiya模型獲得的實際結(jié)合位點數(shù)隨溫度的變化而發(fā)生明顯變化。Tachiya模型得到的結(jié)果更符合小分子與生物大分子相互作用的實際情況。熱力學(xué)數(shù)據(jù)表明KF與BSA之間主要依靠疏水作用力結(jié)合。同時同步熒光光譜發(fā)現(xiàn)KF與BSA的作用可能是通過與色氨酸殘基的結(jié)合而實現(xiàn)的。

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