楊 春，欒新杰，趙美鳳，胡效亞

(揚(yáng)州大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225002)

分子印跡聚合物(MIPs)是在特殊模板分子存在下制備的材料［1］，當(dāng)除去模板分子后，該聚合物具有選擇親和性，能夠吸引或識(shí)別原來(lái)的模板。MIPs在諸如傳感器［2］、催化［3－5］、分離［6－8］、分子識(shí)別［9－11］、抗體模擬［12］以及晶體工程［13］等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)印跡聚合物通常按照非共價(jià)方法合成［14－17］。低位阻的 MIP 由表面印跡［18－19］、納米印跡［20］或凍膠［21］技術(shù)得到。這些材料能夠保證模板與最終聚合物之間的快速吸附－脫附平衡。

復(fù)雜蛋白質(zhì)分析，尤其是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，降低樣品的復(fù)雜性非常重要。到目前為止，很少有方法在脫除高豐度蛋白質(zhì)的同時(shí)，能夠富集樣品中的低豐度組分。一種名為“固態(tài)配體庫(kù)”(Solidphase ligand library)的方法，可從復(fù)雜樣品中同時(shí)萃取高、低豐度蛋白質(zhì)，具有降低主要成分、同時(shí)濃縮低豐度成分的作用［22］。但此法有一定局限性，必須根據(jù)樣品性質(zhì)設(shè)計(jì)、合成特殊的配體庫(kù)。

本文研究了一種蛋白質(zhì)印跡聚合物的新合成方法，既不使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，也無(wú)需合成任何配體。在樣品(雞蛋清)存在下，基于凍膠方法合成聚合物。聚合物在毛細(xì)管中形成，從而得到整體柱。同時(shí)在相同條件下合成了一根對(duì)比柱。通過(guò)對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)樣品中多個(gè)高豐度組分被印跡，印跡整體柱可從樣品溶液中特異地吸附作為印跡模板的高豐度組分，同時(shí)增強(qiáng)低豐度蛋白質(zhì)的信號(hào)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

HPCE-10型毛細(xì)管電泳儀(大連江申分離科學(xué)儀器公司)，紫外吸收檢測(cè)器，采用電滲流進(jìn)樣;毛細(xì)管(內(nèi)徑100 μm，外徑365 μm)購(gòu)自河北省永年銳灃色譜器件有限公司;緩沖溶液為10 mmol/L(pH 8.2)的 Na2HPO4。

丙烯酸、烯丙基胺、丙烯酰胺、N，N'-亞甲基雙丙烯酰胺、3-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS，98%)購(gòu)自山東鵬浩化工;N，N，N'，N'-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過(guò)硫酸銨(APS)購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑公司(上海);其他試劑均為分析純。

樣品的配制:取鮮雞蛋蛋清，溶于8倍體積的磷酸鹽緩沖液，輕搖至蛋清溶解，過(guò)濾，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 印跡、非印跡聚合物整體柱的制備

毛細(xì)管預(yù)處理方法:取一定長(zhǎng)度的毛細(xì)管，分別用0.1 mol/L的NaOH溶液和蒸餾水依次沖洗40 min，注入γ-MAPS(50%體積分?jǐn)?shù)的甲醇溶液)浸泡40 min，N2吹干，120℃恒溫干燥3 h。

表1 單體溶液配比Table 1 Composition of the monomer solution (g/100 mL)

按照表1稱取所需量的單體溶液溶于水，超聲至完全溶解。用注射器將單體溶液分別引入毛細(xì)管中。封閉毛細(xì)管兩端并置于－20℃冰箱中，24 h后取出置于50℃水浴中10 h。

1.3 整體柱的沖洗與印跡整體柱的再生

緩沖液使用前超聲脫氣10 min。整體柱每次實(shí)驗(yàn)前沖洗5～10 min。對(duì)比柱使用緩沖溶液沖洗，印跡柱使用含有3%SDS的緩沖溶液沖洗，并在90℃下至少保持15 min，之后再用緩沖溶液沖洗5 min，以徹底脫去印跡模板蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)分子待定模板印跡方法

理論上，在合成印跡聚合物時(shí)，將一個(gè)樣品加入單體溶液中，若樣品濃度高于某個(gè)值(印跡濃度閾值)，則某些組分可作為模板分子被印跡。最先被印跡的是最高濃度組分，樣品中某組分的濃度越高，被印跡的幾率越高，反之亦然。樣品濃度低于印跡濃度閾值則任何組分均不被印跡。通過(guò)調(diào)節(jié)樣品的濃度，可以改變樣品的印跡行為，即在樣品濃度確定之前，被印跡的組分種類及數(shù)量均未確定。因此，該方法也稱作“待定模板印跡”方法。

待定模板印跡方法對(duì)于復(fù)雜樣品的分析具有特別意義。例如在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，從體液、細(xì)胞或器官中提取的樣品通常非常復(fù)雜，往往含有成百上千的蛋白質(zhì)。從這些樣品中除去高豐度組分，進(jìn)而分析低濃度的生物標(biāo)記物或特殊功能性分子，是一項(xiàng)耗費(fèi)大量時(shí)間及經(jīng)費(fèi)的工作。在此情況下，待定模板印跡方法的出現(xiàn)將大大簡(jiǎn)化復(fù)雜樣品的處理過(guò)程。

待定模板印跡的要點(diǎn)是組分部分印跡，即得到的聚合物對(duì)樣品中高豐度組分具有特異親和性。當(dāng)從聚合物中除去模板分子，并再次作用于原樣品時(shí)，印跡聚合物能選擇性地吸附部分組分(模板)，從而將樣品分成兩部分，一部分吸附于固體上，另一部分留在溶液中(圖1)。通過(guò)調(diào)節(jié)樣品的濃度，可以改變吸附、溶解兩相組分的相對(duì)含量，從而得到一系列復(fù)雜性不同的“次級(jí)樣品”，而每一“次級(jí)樣品”中所含組分都比原樣品簡(jiǎn)單。如果“次級(jí)樣品”比較復(fù)雜，則可以將其作為新的“不定模板”，實(shí)施次級(jí)印跡(圖1標(biāo)出了第二代印跡)。理論上此過(guò)程可以一直進(jìn)行，直到發(fā)現(xiàn)感興趣的目標(biāo)分子，或?qū)⑵湎拗频揭粋€(gè)足夠簡(jiǎn)單的“餾分”中。

圖1 蛋白質(zhì)分子待定模板印跡聚合物與原樣品的作用過(guò)程Fig.1 Schematic presentation of the interaction of the sample and imprinted polymer without standard templates

2.2 聚合物的特點(diǎn)

本文合成的聚合物是兩性電解質(zhì)冰膠，其特點(diǎn)是同時(shí)含有酸性和堿性基團(tuán)，并具有超大孔結(jié)構(gòu)。

同時(shí)使用酸、堿性單體制備蛋白質(zhì)分子印跡聚合物的文獻(xiàn)報(bào)道并不多見［23］。蛋白質(zhì)分子由氨基酸聚合而成，本身是兩性物質(zhì)，因此作為印跡蛋白質(zhì)分子的聚合物，兩性電解質(zhì)可比相似的酸性、堿性聚合物提供更多的相互作用位點(diǎn)，因而其印跡效果應(yīng)該更加顯著。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)聚合物與模板間的親和性相當(dāng)強(qiáng)，其洗脫液中必須添加SDS，且須在加熱的條件下才能順利實(shí)現(xiàn)脫附。另一方面，為了改善分離柱的通透性及提高分離速度，采用了具有超大孔結(jié)構(gòu)的冰膠聚合物。

圖2 聚合物整體柱的掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of the polymers

單體溶液中，添加了比一般冰膠法含量多(～30%，表1)的交聯(lián)劑N，N-亞甲基雙丙烯酰胺。與丙烯酰胺相比，該交聯(lián)劑疏水性稍強(qiáng)，形成的聚合物并非彈性膠狀物，而是呈現(xiàn)蓬松多孔狀結(jié)構(gòu)。印跡與對(duì)照聚合物在外觀上并無(wú)明顯差異，只是印跡聚合物略顯稠厚。圖2是印跡聚合物(MIP)、對(duì)照聚合物(NIP)整體柱的掃描電鏡圖，外觀上兩種聚合物十分相似。

2.3 蛋白質(zhì)在印跡、非印跡聚合物整體柱中的電泳

高豐度組分與單體相互作用，進(jìn)而被印跡到聚合物中。當(dāng)它們被除去后，聚合物中將留下親和性空隙或位點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)的聚合物整體柱在樣品分離中將顯示出有趣的結(jié)果。

從圖3可見，無(wú)論印跡柱還是對(duì)照柱(非印跡柱)，都可實(shí)現(xiàn)雞蛋清樣品的快速分離。對(duì)照柱中電泳實(shí)驗(yàn)在16 min之內(nèi)完成，圖中清楚地呈現(xiàn)出6個(gè)以上的峰(圖3A)，代表樣品中的高豐度組分。經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)電泳譜圖對(duì)比，發(fā)現(xiàn)15 min附近的峰為卵清蛋白，2.5 min的峰為溶菌酶。由于標(biāo)準(zhǔn)品有限，其他譜峰未能定性。

圖3 雞蛋清蛋白質(zhì)在非印跡柱(A)與印跡柱(B)中的電泳圖Fig.3 Electropherograms of chicken egg proteins on non-imprinted column(A)and sample-imprinted column(B)

對(duì)照樣品在兩根柱中的分離結(jié)果(圖3)，發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)主要蛋白質(zhì)的峰信號(hào)出現(xiàn)消失或降低現(xiàn)象。除卵清蛋白(15 min)外，8、13 min處的譜峰消失，11.5 min處的峰高、峰面積大幅降低(圖3B)。溶菌酶(2.5 min)的信號(hào)幾乎消失。由此可見，印跡聚合物中存在針對(duì)高豐度組分的吸附位點(diǎn)，而這正是在聚合物的形成過(guò)程中高豐度組分的印跡行為造成的。雖然部分組分的譜峰降低或消失，但印跡柱中總的峰數(shù)目增加，主要集中在4～10 min之間(圖3B)。這是由于印跡柱中存在特異性吸附位點(diǎn)，能夠保留原來(lái)作為模板的部分高豐度組分，使其信號(hào)降低甚至消失;低豐度組分在單體溶液中濃度未達(dá)到印跡閾值，未發(fā)生印跡，聚合物中不存在相應(yīng)特異性吸附位點(diǎn)，因此這些組分表現(xiàn)出快速遷移行為。在印跡聚合物柱中的進(jìn)樣量是對(duì)比柱中的2倍，所以部分低豐度組分的譜峰清晰可見(圖3B，4.5～8 min)。

3 結(jié)論

待定模板印跡方法可以對(duì)復(fù)雜樣品中的高豐度組分實(shí)施印跡而無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為模板，形成的聚合物具有特異性吸附高豐度組分功能，從而為復(fù)雜樣品的分離、分析提供了新的思路及操作技術(shù)。待定模板印跡聚合物通過(guò)捕獲高豐度組分而增強(qiáng)低豐度組分的信號(hào)，這意味著它們可以用來(lái)從復(fù)雜樣品中脫除高豐度組分，從而大幅度降低樣品復(fù)雜性，便于進(jìn)一步分析處理，且可方便地對(duì)低豐度組分進(jìn)行濃縮富集。根據(jù)待定模板印跡原理可發(fā)展快捷、簡(jiǎn)便、低成本的樣品處理及分離、分析方法，有望在復(fù)雜對(duì)象(如:蛋白質(zhì)組學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)境等)研究領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。

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