宋 宇 石 博 李冬梅 黃可欣

(吉林大學基礎醫(yī)學院形態(tài)學中心，長春130021)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥，臨床上30%～50%的糖尿病患者合并DN，其病理主要表現(xiàn)為系膜區(qū)的膨脹，基底膜的增厚以及出入球小動脈硬化及腎小管的肥大、變性［1］。病變早期可通過腎小球增生而代償，但隨著病變的進一步加重會進入到失代償期，而影響到血流動力學及腎小球濾過率，最終影響腎功能［2］。DN的發(fā)病機制復雜多樣，尚未完全闡明，這也就給DN的治療帶來了極大的困難。本研究室的前期研究證實［3］，大豆皂甙能夠降低血糖水平及升高胰島素水平，對糖尿病的治療有一定的療效。目前，大量研究表明炎癥反應因子IL-6與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關［4］，但大豆皂甙對糖尿病大鼠炎癥反應因子IL-6的作用尚無研究報道。本實驗旨在通過探討大豆皂甙對糖尿病大鼠血、尿及腎臟IL-6的影響，揭示大豆皂甙對糖尿病大鼠腎臟有一定保護作用，IL-6可能參與了糖尿病腎病的發(fā)病及病理變化過程，可能作為判斷糖尿病預后及指導治療的指標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性Wistar大鼠45只，體質量為(210±20)克，由吉林省藥品檢驗所提供(動物合格證號960101032);隨機取10只動物做正常對照組，造模35只，將造模成功的30只動物隨機分為糖尿病對照組(15只)、大豆皂甙給藥組(15只)，在實驗過程中糖尿病對照組動物死亡4只，大豆皂甙給藥組死亡1只。

1.2 主要試劑及儀器 大豆皂甙(SS)由吉林省中醫(yī)中藥研究所提供;實驗用大豆皂甙用生理鹽水稀釋;鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma公司;ELISA試劑盒購于南京建成生物有限公司;一抗IL-6購自Santa Crus公司，二抗、三抗和DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物有限公司;Trizol、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑、dNTP購于北京鼎國生物有限公司;實時熒光定量PCR儀購于美國MJ Research公司。

1.3 動物模型制備及給藥 隨機選取實驗動物35只，稱量體重后，腹腔注射STZ(用新配制的枸櫞酸緩沖液溶解，10 mg/ml)50 mg/kg;48小時后采尾血測空腹血糖，濃度大于16.7 mmol/L為模型復制成功。造模成功后正常對照組、糖尿病模型組和大豆皂甙給藥組分別每日清晨給予灌胃，對照組灌胃生理鹽水、糖尿病模型組灌胃生理鹽水和大豆皂甙給藥組灌胃大豆皂甙(10 mg/kg)，連續(xù)3個月。

1.4 標本采集 動物處死前一天用代謝籠收集24小時尿液，－70℃冰箱凍存，待測。第二天清晨摘取眼球取血，然后迅速處死取出腎臟，左腎凍存用于腎組織IL-6 mRNA及蛋白的測定，右腎固定于10%中性福爾馬林液中，每組取10個腎臟，常規(guī)石蠟包埋，切成5微米切片2張，分別進行HE和免疫組化染色。

1.5 指標檢測

1.5.1 血、尿和腎臟IL-6蛋白的檢測 血、尿及腎臟組織經勻漿后取上清液，酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-6，具體步驟按照試劑盒說明進行。

1.5.2 腎臟IL-6mRNA水平的檢測 腎臟用Trizol提取腎臟組織總RNA，反轉錄后行實時熒光定量PCR檢測 IL-6 mRNA水平;β-actin:上游引物，5'-AGGGAAATCGTGCGTGACATTAAA-3'，下游引物5'-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3'，產物 690 bp;IL-6:上游引物，5'-TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG-3'，下 游 引 物 5'-TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC-3'，產物155 bp。凝膠成像后用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結果。

1.5.3 腎組織的病理檢測 采用HE染色法檢測。

1.5.4 腎組織的IL-6半定量蛋白檢測 采用SP免疫組織化學方法檢測。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數據均以±s表示，采用 t檢驗，檢驗標準α =0.05。

2 結果

對照組大鼠體重明顯增加，精神狀態(tài)好，毛皮有光澤，反應靈敏。糖尿病組大鼠明顯消瘦，精神萎靡，毛皮無光澤，反應遲鈍。大豆皂甙治療組大鼠體重、精神狀態(tài)、毛皮光澤和反應度較對照組差，但明顯好于糖尿病組。

2.1 各組血、尿和腎臟IL-6蛋白水平的比較 糖尿病模型組大鼠血、尿和腎臟IL-6蛋白水平明顯高于對照組和SS給藥組(P＜0.01)，SS給藥組略高于對照組無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);見表1。

2.2 各組腎臟IL-6 mRNA水平的比較 糖尿病模型組大鼠腎臟IL-6 mRNA水平明顯高于對照組和SS給藥組(P＜0.01)，SS給藥組略高于對照組無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);見表2及圖1。

2.3 各組腎組織的IL-6半定量蛋白的比較 免疫組化染色顯示，陽性表達于腎小管細胞質中，棕黃色為免疫組化陽性物質見圖2;糖尿病模型組大鼠腎臟IL-6染色陽性強度明顯高于對照組和SS給藥組(P＜0.01)，SS給藥組略高于對照組無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05);見表2。

2.4 各組腎臟病理改變的比較 HE染色:顯示正常組大鼠腎臟結構清晰，腎小管形狀規(guī)則，腎小管上皮細胞染色均勻;SS給藥組大鼠腎臟結構清晰，腎小管形狀較為規(guī)則，可見少量腎小管上皮細胞變性;模型組大鼠腎組織結構不清晰，腎小球、腎小管形狀較規(guī)則但有腎小管上皮細胞變性;見圖3。

表1 各組血、尿和腎臟IL-6蛋白水平的比較(n=10，±s)Tab.1 Comparision of IL-6 protein in blood，urine and kidney(n=10，±s)

表1 各組血、尿和腎臟IL-6蛋白水平的比較(n=10，±s)Tab.1 Comparision of IL-6 protein in blood，urine and kidney(n=10，±s)

Note:1)P ＜0.01，compared with control group and SS treatment;2)P ＞0.05 compared with control group.

Groups Control Diabetic model SS treatment Blood IL-6(ng/L) 0.83 ±0.16 3.24 ±0.491) 0.91 ±0.332)Urine IL-6(ng/L) 0.62 ±0.15 2.84 ±0.371) 0.69 ±0.182)Kidney IL-6(ng/L)1.26 ±0.61 4.48 ±1.021) 1.38 ±0.822)

圖1 RT-PCR分析IL-6 mRNA的表達Fig.1 RT-PCR analysis of the expression of IL-6 mRNA

表2 各組腎臟IL-6 mRNA及蛋白灰度值水平的比較(n=10，±s)Tab.2 Comparision of IL-6 mRNA and protein gray value in kidney(n=10，±s)

表2 各組腎臟IL-6 mRNA及蛋白灰度值水平的比較(n=10，±s)Tab.2 Comparision of IL-6 mRNA and protein gray value in kidney(n=10，±s)

Note:1)P ＜0.01 compared with control group and SS treatment;2)P ＞0.05 compared with control group.

Groups Control Diabetic model SS treatment IL-6 mRNA 1.07 ±0.34 2.86 ±0.411) 0.98 ±0.142)IL-6 protein(gray value) 156.21 ±4.87 93.46 ±4.151)148.66 ±3.922)

圖2 腎組織中IL-6的表達(免疫組織化學染色，×400)Fig.2 IL-6 expression in kidney tissue(Immunohistochemical staining，×400)

圖3 腎組織病理改變(HE染色，×400)Fig.3 Pathological changes in kidney tissue(HE staining，×400)

3 討論

糖尿病腎病(DN)發(fā)病機制尚未完全清楚，其主要形態(tài)學改變是腎小球硬化，其直接原因是多種細胞外基質成分的積聚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多種生長因子與細胞因子的改變與這些細胞外基質成分的合成及代謝的調節(jié)密切相關［4，5］。

IL-6作為一種肝細胞刺激因子能在肝細胞中誘發(fā)不同的急性期蛋白，作為內源性致熱源，是參與炎癥反應的重要的細胞因子，它可直接作用于胰島β細胞造成其損傷，誘發(fā)胰島素抵抗，通過促使炎癥細胞因子的合成與釋放，促使細胞粘附因子的表達，促進前列腺素E2、血小板活化因子的合成與釋放，使炎癥細胞聚集與粘附，循環(huán)微血管擴張，通透性增強，參與了腎小球組織損傷［4］;能刺激系膜細胞產生氧自由基，從而使過氧化脂質代謝產物增多，造成細胞內膜損傷，損傷基底膜，產生蛋白尿［6，7］。IL-6水平的升高，可引起腎小球濾過屏障和電荷屏障的破壞，同時損壞腎小管上皮細胞，它與系膜細胞上的IL-6受體結合，刺激腎小球系膜的增生和細胞外基質的產生，引起腎小球硬化癥，進而導致糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。由此形成惡性循環(huán)，促進DM的發(fā)展及DN的發(fā)生發(fā)展。此外IL-6還是體內許多細胞產生的一種具有多種生物活性的刺激因子，是機體復雜的細胞因子網絡中的一個重要成員，它可能通過調節(jié)腎小球系膜細胞的有絲分裂，促進該細胞增殖并產生和釋放前列腺素，引起腎小球微血管改變，在DN早期和中期腎小球濾過率增高中起作用［8，9］。本室前期研究表明，大豆皂甙能升高胰島素水平，保護胰島β細胞從而阻斷了IL-6的一系列損傷作用［3］。

綜上所述，本實驗研究結果表明，糖尿病模型組大鼠血、尿及腎組織中IL-6水平顯著地高于正常組(P＜0.01)，經大豆皂甙干預后IL-6水平明顯降低(P＜0.01)，提示大豆皂甙對糖尿病大鼠的腎臟有一定的保護作用，說明IL-6參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展過程，對糖尿病腎臟損害具有顯著的干預治療作用。大豆皂甙干預后IL-6水平下降其機制可能與抑制腎臟內炎癥介質表達有關。因此檢測糖尿病腎病患者血清中IL-6水平，對了解病情，指導臨床和觀察愈后均有十分重要的臨床價值。

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