齊育英 林振忠 明德松

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬寧德市醫(yī)院檢驗科，寧德352100)

乙型病毒性肝炎是我國常見的慢性傳染病之一，嚴(yán)重危害人民健康。人體感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)后臨床轉(zhuǎn)歸差異大，細(xì)胞因子在其中的作用越來越受到重視。HBV感染人體后，免疫細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞因子，可導(dǎo)致病毒清除或持續(xù)感染甚至肝臟損傷的不同結(jié)果，在這些因子中IL-6、IL-10、IL-17分別代表不同亞群特點和作用，在免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中具有重要意義。本研究通過比較慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B，CHB)患者血清中這3種因子的表達(dá)情況，以探討其在CHB發(fā)病機(jī)制中的作用及意義。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2010年7月～2011年8月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬寧德醫(yī)院和福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院住院的CHB患者70例，其中男性54例，女性16例，年齡20～58歲，平均 (30.65±14.26)歲;非重度組46例，重度組24例;HBeAg陽性41例，陰性29例。所有患者診斷均符合病毒性肝炎防治方案和慢性乙型肝炎防治指南［1，2］。全部患者至少3個月內(nèi)未接受過免疫調(diào)節(jié)劑(如胸腺肽、糖皮質(zhì)激素)、保肝及抗病毒治療，排除重疊甲、丙、丁、戊型肝炎病毒、人體免疫缺陷病毒等病毒感染以及有已知遺傳或代謝性肝病、膽汁淤積性肝病、肥胖或自身免疫性肝病、原發(fā)性肝癌等患者。另選同一時期來泉州市第一醫(yī)院門診健康體檢者20例為正常對照組，其中，男性13例，女性7例，年齡21～62歲，平均(36.50 ±13.26)歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本 采集70例CHB患者和20名健康體檢者清晨空腹外周靜脈血5 ml，3 000 r/min離心3分鐘后，分離血清儲存于－80℃待ELISA檢測。

1.2.2 血清細(xì)胞因子檢測 取上述凍存的血清標(biāo)本，室溫凍融后，采用美國MAPKET公司酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒檢測血清中IL-6、IL-10、IL-17表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行，在酶標(biāo)儀 (Alisei Quality System，意大利 SEAC公司)450 nm處讀取數(shù)據(jù)。

1.2.3 其他指標(biāo)檢測 采用美國雅培公司試劑檢測乙型肝炎病毒標(biāo)志物(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)。血清 HBV-DNA定量采用PE9700實時定量熒光檢測儀 (美國PE公司)和血清HBV-DNA試劑盒(中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)。采用全自動酶免分析生化儀(LX-20，美國 Beckman公司)檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素 (DBIL)等生化指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以±s表示，各組間結(jié)果采用Mann-Whitney U檢驗，采用Spearman’s檢驗進(jìn)行相關(guān)性檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象一般臨床資料比較 CHB組與健康對照組在年齡、性別構(gòu)成比等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，各組間具有可比性(P＞0.05)，非重度 CHB組和重度CHB組患者較對照組ALT、AST均明顯升高(P＜0.05)，重度CHB組TBIL較對照組明顯升高(P＜0.05)，重度 CHB組 ALT、AST及 TBIL較非重度組明顯升高(P＜0.05)，結(jié)果見表1。

表1 各組研究對象基本信息(±s)Tab.1 Basic data of each group(±s)

表1 各組研究對象基本信息(±s)Tab.1 Basic data of each group(±s)

Note:1)P ＜0.05，vs health control;2)P ＜0.05，vs CHB non-severe;3)P ＜0.05，vs health control.

n Groups Male Female Age(year)Liver function ALT(U/L) AST(U/L) TBIL(μmol/L)CHB non-severe 35 11 34.61 ±10.89 332.11 ±309.461) 171.03 ±165.071).35 ±1.12 19.00 ±4.75 21.24 ±11.6 CHB severe 19 5 30.29 ±8.64 816.06 ±839.611)3) 457.48 ±446.731)3) 158.53 ±116.962)3)Health control 14 6 36.5 ±13.26 16.4 ±1.91 13

2.2 各組外周血細(xì)胞因子含量比較 與健康對照組相比較，各組CHB患者IL-6、IL-10、IL-17均明顯升高(P＜0.05)，結(jié)果見表2。根據(jù)HBeAg是否陽性，將70例CHB患者分為e抗原陽性和e抗原陰性2組，比較2組間3種細(xì)胞因子的水平，HBeAg陽性組IL-6水平低于陰性組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.104);HBeAg陽性組 IL-10水平高于陰性組，但差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.104);而IL-17水平高于e抗原陰性組(P＜0.05)，結(jié)果見圖1。根據(jù)HBV-DNA滴度的高低，將70例 CHB患者分為HBV-DNA≥105拷貝/ml和 ＜105拷貝/ml兩組，比較2組間3種細(xì)胞因子的差異，結(jié)果3種細(xì)胞因子均無顯著性差異(P＞0.05)，結(jié)果見圖2。

2.3 CHB患者中3種細(xì)胞因子與ALT、AST、TBIL及HBV-DNA的相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，IL-6與AST、TBIL、HBV-DNA均呈正相關(guān)關(guān)系(r分別為0.416、0.374、0.317，P 值均小于 0.05);IL-10 與AST、TBIL、HBV-DNA無明顯相關(guān)關(guān)系(r分別為0.113、－0.025、－0.12，P 值分別為 0.353、0.837、0.33)。IL-17 與 AST、TBIL、HBV-DNA 無明顯相關(guān)關(guān)系(r分別為 －0.084、0.012、0.135，P 值分別為0.489、0.921、0.272)。

圖1 3種細(xì)胞因子在HBeAg陽性、陰性兩組血清中的含量比較Fig.1 Level of 3 cytokines in serum of HBeAg positive group and HBeAg negative group

圖2 3種細(xì)胞因子在HBV-DNA≥105拷貝/ml、＜105拷貝/ml兩組血清中的含量比較Fig.2 Level of 3 cytokines in serum of HBV-DNA≥105copies/ml and ＜105copies/ml group

表2 各組對象血清中3種細(xì)胞因子表達(dá)情況(±s)Tab.2 Level of 3 cytokine in serum of each group(±s)

表2 各組對象血清中3種細(xì)胞因子表達(dá)情況(±s)Tab.2 Level of 3 cytokine in serum of each group(±s)

Note:1)P ＜0.05，vs CHB non-severe and severe;2)P ＜0.05，vs CHB non-severe.

IL-6 IL-10 IL-17 Groups n CHB non-severe 46 4.83 ±6.23 95.73 ±107.97 125.95 ±43.19 CHB severe 24 11.32 ±20.372)69.52 ±66.49 137.38 ±54.56 Health control 20 2.78 ±2.001)26.74 ±19.211)91.42 ±35.481)

3 討論

乙型肝炎是一種免疫相關(guān)疾病，HBV感染人體后對肝細(xì)胞無明顯的損傷作用，而是通過誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)間接損傷肝細(xì)胞，同時，機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)又發(fā)揮著清除病毒的作用［3］。HBV感染的轉(zhuǎn)歸主要取決于病毒和機(jī)體免疫應(yīng)答2個方面，機(jī)體免疫功能紊亂，尤其是T淋巴細(xì)胞亞群與其細(xì)胞因子的失調(diào)與慢性肝病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［4，5］。外周成熟的T淋巴細(xì)胞無論在表型上還是功能上都是異質(zhì)性群體，按其表型不同可分為CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞，按其功能不同則可分為輔助性T淋巴細(xì)胞(helper T lymphocyte，Th)、抑制性T淋巴細(xì)胞(suppressor T lymphocyte，Ts)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)。目前認(rèn)為，幼稚CD4+T淋巴細(xì)胞在不同細(xì)胞因子作用下可以分化為 Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T lymphocyte，Treg)4個主要的功能成熟的亞群，分別通過不同的轉(zhuǎn)錄途徑和特征性的細(xì)胞因子執(zhí)行不同的生物學(xué)功能，形成一個巨大的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)體系［6］。一種細(xì)胞因子往往有多種生物活性，而多種細(xì)胞因子又可有共同的生物活性，不同的細(xì)胞因子之間形成網(wǎng)絡(luò)，相互調(diào)節(jié)產(chǎn)生和發(fā)揮效應(yīng)，而這些細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)失調(diào)與慢性肝病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。其中，Th1主要產(chǎn)生 IL-2、IL-12、TNF-β、IL-18、干擾素-γ(IFN-γ)等，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答;Th2 主要產(chǎn)生 IL-4、IL-5、IL-10、IL-14 等，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答;Th17以表達(dá)IL-17A為特征，同時也分泌 IL-17F、IL-22、IL-21、IL-6 等因子，是 HBV 感染的主要致炎細(xì)胞亞群;Treg細(xì)胞通過細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸及釋放IL-10和TGF-β等抑制因子，維持自身免疫耐受［7-10］。在這些因子中 IL-6、IL-10、IL-17 分別代表了不同亞群特點和作用，在免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)中具有重要意義。

IL-6為體內(nèi)重要的致炎性細(xì)胞因子，可以調(diào)節(jié)許多急性期反應(yīng)蛋白的合成，同時也是一種與慢性肝病患者免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的因子［11］，在急、慢性肝損傷早期即呈高水平表達(dá)。正常人外周血清中IL-6的濃度很低，往往低于5 kU/L［12］，其在大多數(shù)正常靜息細(xì)胞中并不表達(dá)，但在感染或其他因素刺激下，T淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞被激活，導(dǎo)致 IL-6合成和釋放增加，反過來促進(jìn)激活的T細(xì)胞增殖，刺激未成熟的胸腺細(xì)胞分化為成熟的CTL，從而清除細(xì)胞內(nèi)病毒，但同時增強(qiáng)了肝臟的炎癥反應(yīng)，從而加重肝細(xì)胞的損傷［13］。研究發(fā)現(xiàn)血清 IL-6在肝炎、肝硬化性肝炎的急性期顯著高于正常人群，且在病情嚴(yán)重或死亡者升高更明顯，并與白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量、C反應(yīng)蛋白(CRP)和TBIL水平正相關(guān)，與血清總蛋白水平負(fù)相關(guān)，認(rèn)為 IL-6的升高與 CHB的嚴(yán)重度相關(guān)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，對于CHB患者，重度組IL-6水平較非重度組及健康對照組明顯升高，IL-6與AST、TBIL均呈正相關(guān)關(guān)系，血清AST、TBIL水平是反映肝臟功能的常用指標(biāo)，說明血清IL-6水平與肝細(xì)胞壞死程度密切相關(guān)。通過對IL-6與HBV-DNA進(jìn)行相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)IL-6與HBV-DNA呈正相關(guān)，可能為HBV DNA載量增加可進(jìn)一步導(dǎo)致乙肝患者細(xì)胞免疫功能紊亂加重，從而產(chǎn)生和釋放IL-6，促進(jìn)炎性反應(yīng)。有報道認(rèn)為，通過抗HBV治療后，降低病毒載量，進(jìn)而降低IL-6，對肝細(xì)胞功能恢復(fù)有一定的促進(jìn)作用［15］，進(jìn)一步說明血清IL-6水平與肝細(xì)胞壞死程度密切相關(guān)。

IL-10為體內(nèi)重要的抗炎性細(xì)胞因子，通過抑制Th1細(xì)胞的增殖和IL-2、IFN、白三烯等細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而抑制Th1型免疫應(yīng)答［16］，降低患者的細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)Treg的增殖和活化，從而有利于誘導(dǎo)機(jī)體對外來病原的耐受，導(dǎo)致乙肝病毒持續(xù)存在［17］。本研究顯示，CHB各組患者血清IL-10水平較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，非重度組IL-10高于重度組，提示優(yōu)勢Th2型細(xì)胞因子IL-10抑制Th1細(xì)胞應(yīng)答，使機(jī)體不能有效清除受病毒感染的肝細(xì)胞，造成HBV感染的持續(xù)，而隨著炎癥的加重，IL-10呈下降的趨勢。本研究同時發(fā)現(xiàn)不同的e抗原情況2組IL-10水平差別無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與2組間HBV-DNA水平無顯著性差異有關(guān)。賴婭芳等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，血清中HBV-DNA定量與IL-10水平高度正相關(guān)，提示IL-10水平升高可以抑制宿主抗HBV細(xì)胞免疫活性，導(dǎo)致HBV在體內(nèi)的持續(xù)復(fù)制與表達(dá)，是乙肝病毒感染慢性化的主要原因。但本研究按HBV-DNA載量高低進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)2組的IL-10水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是由于外周血的檢測反映的是循環(huán)中的總效應(yīng)和總水平，并不反映炎癥局部的細(xì)胞因子表達(dá)情況［19］。

IL-17主要是由活化的記憶性CD4+T淋巴細(xì)胞(即Th17細(xì)胞)分泌的特異性的促炎癥效應(yīng)因子［20］，可以促進(jìn)機(jī)體局部產(chǎn)生趨化因子如IL-8、IL-6等，使單核細(xì)胞及中性粒細(xì)胞迅速增長，增強(qiáng)局部炎癥，誘導(dǎo)其致炎因子引起組織損害。有研究發(fā)現(xiàn)大部分的CHB患者的血清和肝組織IL-17與HBVDNA、ALT水平呈正相關(guān)［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，CHB 患者各組IL-17水平均較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示IL-17與肝臟炎癥關(guān)系密切，但相關(guān)性分析并未發(fā)現(xiàn)其與肝臟炎癥水平呈正相關(guān)，因此，IL-17可能參與了HBV誘導(dǎo)的肝臟的病理損傷，但是否參與了清除病毒的T細(xì)胞免疫，目前尚不明確，需要進(jìn)一步的研究。同時，本研究按HBV-DNA水平高低進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)2組間的IL-17水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步行相關(guān)性分析，亦未發(fā)現(xiàn)IL-17與HBV-DNA水平呈正相關(guān)關(guān)系，可能因為IL-17介導(dǎo)的肝細(xì)胞炎性損傷并沒有在乙肝患者長期慢性感染中起主要作用。

本研究通過比較CHB患者血清中IL-6、IL-10、IL-17的表達(dá)情況，初步闡明了這3種細(xì)胞因子在HBV感染慢性化中的作用及意義，為針對HBV的免疫治療提供細(xì)胞因子方面的理論依據(jù)和新的思路。

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