崔海寧 陳儉云 王正文 張克君 余壯明 王齊全 王明華 朱東明 宋彩霞 張澤米

(海南醫(yī)學院附屬醫(yī)院普外科，海口570102)

人的Slug基因位于8號染色體上，基因全長2.4 kb，含有3個外顯子，2個內(nèi)含子。Slug在胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤細胞中高表達。Hotz等[1]研究顯示，Slug在胰腺癌組織中高表達，而在正常胰腺組織中無表達或低表達，表明Slug與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Vannini等[2]研究表明，Slug在惡性腫瘤中過表達，并且能上調(diào)細胞內(nèi)VEGF蛋白表達。Slug基因在浸潤和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中，以及在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，均有重要作用。我們構(gòu)建rAAV-siRNA-Slug-U6載體，運用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗檢測rAAV2-EGFP-SlugsiRNA-U6對細胞血管生成的影響，探索rAAV-siRNA-Slug-U6對胰腺癌細胞株AsPC-1 Slug與VEGF基因的表達的影響，探討rAAV2-EGFP-Slug-siRNAU6抑制血管生成的機制。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 胰腺癌細胞株AsPC-1購自中國科學院上海細胞研究所，培養(yǎng)條件:用含10% 胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃、5%CO2、飽和濕度，指數(shù)生長的AsPC-1細胞為實驗對象。每2～3天用0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代培養(yǎng)。

rAAV2-EGFP-Slug-siRNA-U6載體的構(gòu)建、包裝和純化(前期實驗完成)，rAAV2-EGFP-Slug-siRNA的滴度為9.23×1010(puf)。Slug、VEGF基因引物及RT-PCR試劑盒購自武漢市晶賽工程技術有限公司，Slug及VEGF多克隆抗體及β-Actin抗體購自Santa Cruz公司、二抗購自北京中山生物技術有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗檢測rAAV2-EGFP-Slug-siRNA-U6對細胞血管生成的影響 選擇質(zhì)量相近(50±5)g，表面清潔，無破損的新鮮45枚種蛋，消毒后，置于溫度(37.5±0.5)℃、相對濕度70% 的恒溫孵化箱中孵育，每8小時轉(zhuǎn)蛋1次。孵育7天后，將種蛋隨機分為 3組，即分實驗組(rAAV2-EGFP-Slug-siRNA-U6)、陰性對照組(rAAV2-EGFP)和空白對照組(生理鹽水)，每組15枚。

7天后，在氣室表面用牙科鉆在蛋胚頂端挖去1.0 cm×1.0 cm大小蛋殼和殼膜，暴露出氣室膜，用無菌注射針頭在氣室膜上從氣室與卵黃分隔處輕輕劃破一小孔，勿傷及下面的雞胚絨毛尿囊膜(CAM)。用微量移液器分別滴加100 μl rAAV2-EGFP-Slug-siRNA-U6，rAAV2-EGFP和生理鹽水，使氣室膜與雞胚絨毛尿囊膜(CAM)分開，用鑷子輕輕去掉上層的氣室膜，暴露出下層的雞胚絨毛尿囊膜(CAM)。用滅菌透明膠紙封閉卵殼口，繼續(xù)放入恒溫箱中孵育3天，停止轉(zhuǎn)蛋，通過透明膠紙觀察雞胚胎成活情況。

10天后，揭去透明膠紙，加預冷固定液固定30分鐘，待雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血液完全凝固后，去掉CAM上方的卵殼、卵殼膜及氣室膜，完整剪下CAM，置于有預冷固定液的器皿中再固定30分鐘，然后將CAM平鋪于潔凈玻片上，自然晾干，用數(shù)碼相機照相，在電腦上放大10倍后進行血管計數(shù)。血管記數(shù)方法:在電腦屏幕上隨機選5個視野，計算屏幕范圍內(nèi)可見的血管分支的數(shù)量，取平均數(shù)。

1.3 rAAV2-siRNA-Slug-U6對胰腺癌細胞株AsPC-1細胞內(nèi)Slug及VEGF基因的表達的影響

1.3.1 RT-PCR檢測rAAV2-siRNA-Slug-U6感染前后AsPC-1細胞內(nèi)Slug及VEGF mRNA表達 用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃、5%CO2、飽和濕度，指數(shù)生長的AsPC-1細胞為實驗對象。每2～3天用0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代培養(yǎng)。取12孔細胞培養(yǎng)板，每孔分別接種細胞2×105，分為3組，即分實驗組(rAAV2-EGFP-SlugsiRNA-U6)、陰性對照組(rAAV2-EGFP)和空白對照組(生理鹽水)，用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，細胞約80%融合。在感染后24小時，抽提12孔板細胞的總RNA，根據(jù)RT-PCR試劑盒的方法檢測Slug及VEGF mRNA。PCR反應條件為:95℃預變性5分鐘，95℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸60秒(共進行30個循環(huán))，72℃延伸10分鐘，放置于4℃冰箱備用。取10 μl，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳;EB染色10分鐘，用Bio-Rad公司的凝膠電泳成像儀成像，以Quantity one分析各條帶的吸光度，計算Slug及VEGF mRNA的相對值。

1.3.2 Western blot檢測 rAAV2-siRNA-Slug-U6感染前后AsPC-1細胞內(nèi)Slug及VEGF蛋白表達 感染24小時后，棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，消化細胞轉(zhuǎn)移至EP管，室溫1 000 r/min離心10分鐘，加入100 μl預冷的RIPA裂解液，輕輕吹打混勻，置冰上30分鐘，沸水煮沸10分鐘，4℃ 13 000 r/min離心20分鐘，-20℃保存;按試劑盒說明檢測蛋白含量。做10%分離膠，做堆積膠，加樣，每種樣品點蛋白總量為20 μg，制轉(zhuǎn)膜液，電泳完畢后，取出聚丙烯酰胺凝膠，按以下層次放置于轉(zhuǎn)膜夾中:黑板-纖維-吸水濾紙-聚丙烯酰胺凝膠 -PVDF膜 -吸水濾紙-纖維-白板，置入轉(zhuǎn)膜槽，120 V恒壓轉(zhuǎn)膜2小時，1小時后換冰;轉(zhuǎn)入4℃封閉過夜;加一抗，洗一抗，加二抗，洗二抗，DAB顯色5分鐘;凝膠成像測灰度行數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 實驗在相同條件下重復3次。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s描述，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗檢測rAAV2-EGFP-Slug-siRNA-U6對細胞血管生成的影響 從結(jié)果可以看出陰性對照組和空白對照組血管生長良好，毛細血管清晰可見，主血管粗壯，分支適中。試驗組毛細血管數(shù)量明顯減少，血管變細模糊。用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)軟件對數(shù)據(jù)進行定量分析。陰性對照組和空白對照組比較 P＜0.05，陰性對照組和試驗組比較P＞0.05，詳見圖 1。

圖1 雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗檢測rAAV2-EGFPSlug-siRNA-U6對細胞血管生成的影響Fig．1 Influence of rAAV2-EGFP-Slug-siRNA-U6 cell on angiogenesis by Chick chorioallantoic membrane(CAM)assay

圖2 Slug及VEGF mRNA表達的檢測Fig．2 Detection mRNA of Slug and VEGF

2.2 胰腺癌AsPC-1細胞內(nèi)Slug及VEGF蛋白與mRNA表達的檢測 空白對照組AsPC-1細胞內(nèi)Slug及VEGF蛋白和mRNA表達明顯，細胞感染Slug-siRNA 24小時后，細胞內(nèi)Slug蛋白和mRNA表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。陰性對照組Slug及VEGF蛋白和mRNA無明顯改變，說明實驗組細胞內(nèi)Slug及VEGF被抑制，詳見圖2、3。

3 討論

圖3 Slug及VEGF蛋白表達的檢測Fig．3 Detection protein of Slug and VEGF

胰腺癌為最常見的消化道惡性腫瘤之一，其惡性程度高，手術切除率不足20%，5年生存率低于4%。根據(jù)美國癌癥統(tǒng)計，2012年新發(fā)胰腺癌男性22 090例，死亡 18 850例;女性 21 830例，死亡18 540例。胰腺癌死亡原因男女均占癌癥死亡原因的第4位[3]。胰腺癌對常規(guī)手術、化療和放療等治療方法效果不理想，近年來對胰腺癌分子生物學的深入研究，基因治療成為胰腺癌治療的新策略。

Perez-Mancera等[4]研究表明，轉(zhuǎn)染 Slug基因可導致鼠惡性腫瘤的發(fā)生，Slug基因可能在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Shioiri等[5]研究表明，Slug是結(jié)直腸癌預后差的獨立危險因素。抑制Slug基因表達可能具有抗腫瘤作用。人的Slug基因位于8號染色體上，基因全長2.4 kb，含有3個外顯子，2個內(nèi)含子。Slug在胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、口腔鱗癌等多種惡性腫瘤細胞中高表達，抑制Slug表達可影響腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[6-11]。Snail基因超家族是一類轉(zhuǎn)錄抑制因子家族，Slug與snail均是snail家族中的成員，Slug與snail基因在惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中通過不同的機制發(fā)揮作用[12，13]。Hot等[1]研究顯示，Slug 在胰腺癌組織中高表達，而在正常胰腺組織中無表達或低表達，表明Slug與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。研究表明，VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)是目前作用最強、特異性最高的血管生成調(diào)控因子。VEGF誘導腫瘤產(chǎn)生新生微血管，具有較高的通透性。使癌細胞更容易滲透到微血管，進入微循環(huán)，進而遠處轉(zhuǎn)移。同時促使血漿蛋白滲出到胞外基質(zhì)，利于成纖維細胞和內(nèi)皮細胞生長，共同形成富含血管的腫瘤基質(zhì)，促進腫瘤的生長浸潤。VEGF還能作為自分泌生長因子促進腫瘤細胞的增殖。Vannini等[2]研究表明，Slug在惡性腫瘤中過表達，并且能上調(diào)細胞內(nèi)VEGF蛋白表達。由此推測，干擾Slug基因治療可能起到抗胰腺癌的作用。

rAAV(腺相關病毒)專一性強、對腫瘤細胞有嗜性，是目前用于基因治療較安全有效的腺相關病毒載體。Folkman等學者首先提出腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移均依賴于新生血管形成的理論，該理論認為腫瘤形成初期通過滲透從附近組織或器官獲得充足的營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣，同時能將細胞的代謝產(chǎn)物運走，此時腫瘤內(nèi)無血管生成。這種情況下腫瘤體積只能維持在約2 mm3，細胞數(shù)量也只有約幾百萬個，這種腫瘤體積微小狀態(tài)的情況會持續(xù)較長一段時間[14，15]。當腫瘤體積增至2 mm3～3 mm3時，若沒有新生毛細血管生成，僅依靠滲透作用從周圍毛細血管獲取營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣，無法維持腫瘤細胞自身生長，腫瘤組織將維持休眠狀態(tài)或發(fā)生萎縮[16]。相反，如果腫瘤內(nèi)有新生的血管形成，腫瘤將從血液循環(huán)得到充足的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，使腫瘤呈指數(shù)級的速度生長，體積將在短時間內(nèi)迅速增大。由此可見，腫瘤的生長與血管生成有著密切的關系。近些年，隨著分子生物學的進展，通過抑制新生血管形成來抑制腫瘤生長的研究成為抗腫瘤研究領域的熱點之一，諸多此類藥物已經(jīng)進入Ⅲ期臨床試驗，并取得了較好的療效。雞胚絨毛尿囊膜(CAM)是目前研究血管形成與抗血管形成的較為理想的實驗方法之一[17-19]。

本實驗運用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗檢測rAAV2-EGFP-Slug-siRNA-U6抑制細胞血管的生成。在體外實驗中，rAAV2-EGFP-Slug-siRNA-U6抑制Slug及VEGF mRNA與蛋白的表達。差異具有統(tǒng)計學意義。陳彥福等運用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將表達siRNA-Slug的真核表達載體pSlug-siRNA導入ASPC-1細胞，RNA干擾Slug基因，運用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)試驗檢測血管生成表明，Slug-siRNA抑制新生血管的生成[20]。Vannini等[2]研究表明，Slug 在黑色素瘤中過表達，并且能上調(diào)細胞內(nèi)VEGF蛋白表達。

本研究表明，Slug可能是胰腺癌基因治療的有效靶點，Slug基因的腺相關病毒 RNA干擾載體rAAV2-EGFP-Slug-siRNA-U6可能通過抑制Slug及VEGF基因的表達而抑制細胞血管生成為進一步進行體內(nèi)實驗提供實驗依據(jù)。

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