陳鄭禮 孫 瑜 王俊杰 酈佳慧 韓 姝 夏照帆

(第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院燒傷科，上海200433)

炎癥是機(jī)體對感染、體內(nèi)抗原抗體結(jié)合以及機(jī)械損傷的一種自身反應(yīng)。適度的炎癥反應(yīng)是有益的，而過度的或持續(xù)的炎癥反應(yīng)則會引起組織損傷和誘發(fā)疾病。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)可以糾正炎癥反應(yīng)的失調(diào)，在臨床中常被用來治療包括膿毒性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征、急性呼吸窘迫綜合征等急性炎癥反應(yīng)引起的疾病和哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球腎炎、多發(fā)性硬化、銀屑病等慢性炎癥反應(yīng)異常引起的疾病[1]。巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor，MIF)是一種主要由巨噬細(xì)胞、激活的T細(xì)胞及垂體前葉促腎上腺皮質(zhì)素細(xì)胞等合成和分泌的多功能細(xì)胞因子，參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移等多種病理生理反應(yīng)[2]。迄今為止，MIF是唯一被認(rèn)為能負(fù)向調(diào)節(jié)GC抗炎作用的細(xì)胞因子，它可能與局部或全身炎癥、自身免疫性疾病等密切相關(guān)，亦可能是GC不能有效發(fā)揮抗炎作用的關(guān)鍵因子[2]。MIF是如何抵抗糖皮質(zhì)激素的抗炎作用的，其機(jī)制至今仍未完全闡明。本研究的目的在于闡明MIF抵抗糖皮質(zhì)激素的抗炎作用及其細(xì)胞內(nèi)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞系RAW264.7由本實(shí)驗(yàn)室保存;糖皮質(zhì)激素(Dex)由第二軍醫(yī)大學(xué)病理生理學(xué)教研室盧建教授惠贈(zèng);重組的小鼠MIF細(xì)胞因子購自R＆D公司;兔抗小鼠Annexin 1的抗體購自Santa Cruz公司;HRP標(biāo)記的小鼠β-actin單克隆抗體購自Sigma公司;羊抗小鼠的前列腺素E2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)的ELISA試劑盒購自Adlitteram Diagnostic Laboratories公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，隔天傳代。

1.2.2 去激素血清制備 參照文獻(xiàn)用DCC(Dextran-coated charcoal)方法進(jìn)行[3]。過程如下:分別稱取活性炭2 g、Dextran T-70 200 mg，用去離子水定容至100 ml，用在磁力攪拌機(jī)上攪拌1小時(shí)后，以4 000 r/min的速度離心10分鐘，去上清后在離心管內(nèi)加入100 ml的小牛血清，并與沉淀混勻，在磁力攪拌機(jī)上攪拌30分鐘后，在超速離心機(jī)中，20 000 r/min，離心15分鐘，重復(fù)一次后將上清與無酚紅的RPMI1640混合，過濾除菌后，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ELISA方法檢測上清中PGE2和LTB4的含量 不同濃度的LPS、MIF、Dex刺激RAW264.7后檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中PGE2和LTB4含量的變化?；蛳燃尤隓ex或Dex+MIF孵育1小時(shí)，在給予LPS刺激4小時(shí)后檢測上清中PGE2和LTB4的變化。

1.2.4 Western blot方法測定蛋白水平 不同濃度的LPS、MIF、Dex刺激RAW264.7細(xì)胞后，收集全細(xì)胞蛋白標(biāo)本，常規(guī)BCA方法進(jìn)行蛋白定量。制備12%聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(2小時(shí))，轉(zhuǎn)移到NC膜(50分鐘)，室溫5%BSA封閉1小時(shí)，與目標(biāo)蛋白抗體孵育4℃過夜，TBST洗膜3次，加HRP偶聯(lián)的二抗(1∶5 000)，孵育90分鐘，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯色曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示。組間比較采用ANOVA方差分析。方差齊性時(shí)使用SNK法，方差不齊時(shí)采用Dunnett’C方法作多重比較。P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 MIF負(fù)向調(diào)節(jié)地塞米松(Dex)對RAW細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)的抑制作用 將長勢良好的RAW264.7細(xì)胞以2×105/孔密度接種六孔板，在37℃、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)，鏡下觀察細(xì)胞融合率達(dá)到90%時(shí)，分別加入MIF(1、10、50、100 ng/ml)、LPS(0.1、1、10 μg/ml)、Dex(10、100、1 000 nmol/L)處理 4 小時(shí)，并設(shè)對照組(表示為 MIF 0 ng/ml)，檢測上清液中 PGE2和LTB4的含量。結(jié)果如圖1所示，不同濃度的MIF和LPS都可以促進(jìn)RAW細(xì)胞產(chǎn)生PGE2，且呈劑量依賴性。大于10 ng/ml的MIF和大于1.0 μg/ml的LPS處理細(xì)胞后產(chǎn)生的PGE2與對照組相比顯著升高(P＜0.01)。不同濃度的Dex處理后對細(xì)胞產(chǎn)生PGE2沒有影響。

同樣的結(jié)果如圖2所示，不同濃度的MIF和LPS都可以促進(jìn)RAW細(xì)胞產(chǎn)生LTB4，且呈劑量依賴性。大于50 ng/ml的MIF和大于0.1 μg/ml的LPS處理細(xì)胞后產(chǎn)生的LTB4與對照組相比顯著升高(P＜0.01)。不同濃度的Dex處理后對細(xì)胞產(chǎn)生LTB4仍沒有影響。鑒于上述的結(jié)果，我們在下面的實(shí)驗(yàn)中，將MIF的處理濃度定為10 ng/ml，LPS為100 ng/ml。

圖1 不同濃度MIF、LPS和Dex對RAW264．7細(xì)胞上清液中PGE2含量的影響Fig．1 The effect of different concentration of MIF，LPS and Dex on PEG2 production in the supernatant of RAW cells

圖2 不同濃度MIF、LPS和Dex對RAW264．7細(xì)胞上清液中LTB4含量的影響Fig．2 The effect of different concentration of MIF，LPS and Dex on LTB4 production in the supernatant of RAW cells

圖3 MIF負(fù)向調(diào)節(jié)Dex對PGE2產(chǎn)生的抑制作用Fig．3 MIF counter-regulates Dex-induced inhibition of PGE2 production by RAW macrophages

在長勢良好的細(xì)胞中預(yù)先加入 Dex(1、10 nmol/L)或 Dex(1、10 nmol/L)和 MIF(1、10 ng/ml)孵育1小時(shí)，再加入LPS(100 ng/ml)處理4小時(shí)后，檢測上清液中PGE2和LTB4的含量。如圖3和圖4所示，MIF以劑量依賴的方式負(fù)向調(diào)節(jié)了Dex對PGE2和LTB4的抑制作用。10 ng/ml的MIF完全逆轉(zhuǎn)了 Dex抑制 PGE2和 LTB4產(chǎn)生的效應(yīng)(P＜0.05)。

2.2 MIF負(fù)向調(diào)節(jié)Dex誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞Annexin 1的表達(dá) Dex能誘導(dǎo)膜聯(lián)蛋白Annexin 1的表達(dá)來抑制脂質(zhì)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎作用。前面的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)MIF能負(fù)向調(diào)節(jié)Dex對脂質(zhì)炎癥介質(zhì)PGE2和LTB4的抑制作用，那么作為能抑制這兩個(gè)脂質(zhì)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的上游抗炎蛋白，Annexin 1是否也受到MIF的影響呢?我們在長勢良好的細(xì)胞中預(yù)先加入Dex(100 nmol/L)或Dex(100 mol/L)和MIF(10 ng/ml)孵育1小時(shí)，再加入LPS(100 ng/ml)處理30分鐘后，提取胞漿蛋白用Western blot的方法檢測Annexin 1的表達(dá)。如圖5所示，MIF和 LPS均下調(diào)了 Annexin 1的表達(dá)，而Dex明顯誘導(dǎo)了Annexin 1的表達(dá)(P＜0.01)。LPS和Dex合用能更加顯著地促進(jìn)Annexin 1的表達(dá)，而加入10 ng/ml的MIF就能明顯逆轉(zhuǎn)上述作用(P＜0.01)，初步顯示出MIF負(fù)向調(diào)節(jié)Dex誘導(dǎo)Annexin 1表達(dá)的作用。

圖4 MIF負(fù)向調(diào)節(jié)Dex對LTB4產(chǎn)生的抑制作用Fig．4 MIF counter-regulates Dex-induced inhibition of LTB4 production by RAW macrophages

圖5 MIF、LPS、Dex對RAW細(xì)胞表達(dá)Annexin 1的影響Fig．5 The effect of MIF，LPS and Dex on Annexin 1 expression in RAW macrophages

圖6 MIF以劑量依賴方式負(fù)向調(diào)節(jié)Dex誘導(dǎo)Annexin 1的表達(dá)Fig．6 MIF counter-regulates Dex-induced Annexin 1 upregulation in macrophages

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步證實(shí)MIF負(fù)向調(diào)節(jié)Dex誘導(dǎo)Annexin 1表達(dá)的作用。RAW細(xì)胞用 Dex(100 nmol/L)或 Dex(100 mol/L)和 MIF(10、100、1 000 ng/ml)處理1小時(shí)，檢測Annexin 1的表達(dá)。如圖6，MIF以劑量依賴方式明顯抑制了Dex誘導(dǎo)Annexin 1的表達(dá)(P＜0.01)。

3 討論

MIF最早被認(rèn)為是T細(xì)胞來源的淋巴因子，因能抑制巨噬細(xì)胞的遷移而得名。隨后研究表明除了T細(xì)胞外，其它合成和釋放MIF的細(xì)胞還有巨噬細(xì)胞、各種組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。人類MIF基因位于22號染色體，由三個(gè)外顯子和兩個(gè)內(nèi)含子組成。MIF是含115個(gè)氨基酸、分子量為12.5 kD的蛋白質(zhì)，它與已知的蛋白質(zhì)之間無明顯的氨基酸同源性，不屬于任何已知的細(xì)胞因子家族，并且具有多種生物學(xué)功能。MIF不僅作為重要的細(xì)胞因子參與機(jī)體的炎癥及免疫反應(yīng)，而且和細(xì)胞的生長及分化有著密切的聯(lián)系[4]。越來越多的文獻(xiàn)表明，MIF涉及機(jī)體各種炎癥性、自身免疫性疾病及多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制。

如前所述，MIF的另一個(gè)重要特點(diǎn)是具有拮抗GC抑制炎癥的作用(Counter-regulate inhibitory effect of glucocorticoids)[2]。MIF 不但在全身多種炎癥性疾病中高表達(dá)，而且還能拮抗GC的抗炎作用，然而目前大多數(shù)炎癥性疾病臨床上仍需依賴GC治療，因而MIF的存在可能大大減弱了GC對于炎癥性疾病的療效。本文研究的重點(diǎn)即闡明MIF是如何拮抗GC的抗炎作用，明確其中的分子機(jī)制，旨在尋找關(guān)鍵性靶點(diǎn)，消除MIF對GC作用的影響，進(jìn)一步提高GC對炎癥性疾病的療效。

以往的研究證實(shí) MIF能負(fù)向調(diào)節(jié) GC抑制TNF-α、IL-1等促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放，對于脂質(zhì)炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)作用未見報(bào)道。我們的研究首先證實(shí)了MIF能夠以劑量依賴方式負(fù)向調(diào)節(jié)GC抑制脂質(zhì)炎癥介質(zhì)PGE2和LTB4的產(chǎn)生。這一發(fā)現(xiàn)又補(bǔ)充了MIF拮抗GC抗炎作用的內(nèi)容。在介導(dǎo)脂質(zhì)炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，已知胞漿內(nèi)的磷酸酯酶A2α(cPLA2α)是重要的酶，cPLA2α的磷酸化可以促使花生四烯酸的產(chǎn)生和向類花生酸類物質(zhì)的轉(zhuǎn)變(如前列腺素、血栓素、前列環(huán)素和白三烯)[5，6]。已知 GC 可以誘導(dǎo)抗炎蛋白 Annexin 1 的表達(dá)，從而抑制cPLA2α的活性，那么MIF負(fù)向調(diào)節(jié)GC的作用是發(fā)生在上述通路中的哪個(gè)環(huán)節(jié)呢?

已有報(bào)道部分揭示了MIF對抗GC作用的機(jī)制。GC可通過快速、持續(xù)的誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(MAP kinase phosphatase-1，MKP-1)的基因表達(dá)，進(jìn)而反饋抑制p38活化，而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制促炎癥因子的基因表達(dá)。MKP-1屬于MKP家族的一員，能夠通過去磷酸化MAPKs的絲/蘇氨酸或氨基酸殘基而使MAKP失活。MKP-1在機(jī)體中組成型表達(dá)，但能被GC強(qiáng)誘導(dǎo)。GC通過誘導(dǎo)MKP-1基因表達(dá)及減少M(fèi)KP-1蛋白降解使MKP-1合成增加。Aeberli等[7]發(fā)現(xiàn)在MIF基因敲除動(dòng)物的腹腔巨噬細(xì)胞中，內(nèi)源性或重組的MIF可對抗GC誘導(dǎo)的MKP-1表達(dá)，可造成p38 MAPK持續(xù)活化。而p38 MAPK的持續(xù)活化即可通過調(diào)節(jié)活化蛋白1的活性在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)。Roger等[8]也發(fā)現(xiàn)在RAW264.7巨噬細(xì)胞系，重組MIF對GC誘導(dǎo)的MKP-1表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。上述研究表明MKP-1成為MIF拮抗GC抗炎作用的關(guān)鍵蛋白之一。

此外，Daun等[9]研究發(fā)現(xiàn)，GC 通過與胞漿中的受體(GR)結(jié)合為復(fù)合物并轉(zhuǎn)移到核中，促進(jìn)IκB的轉(zhuǎn)錄，從而抑制炎癥介質(zhì)的釋放。而IκB是一種阻礙蛋白，可阻礙免疫細(xì)胞胞漿中的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的釋放，如果 IκB崩解則NF-κB可釋放并活化，轉(zhuǎn)移到胞核中激活炎癥因子的轉(zhuǎn)錄。MIF正是通過抑制GC對胞漿中IκBα表達(dá)的上調(diào)，以對抗激素在NF-κB/IκB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的效應(yīng)，進(jìn)而阻斷了其對炎癥因子表達(dá)的限制作用[9]。這就表明IκBα也成為了MIF拮抗GC作用的關(guān)鍵性靶點(diǎn)。

MKP-1和IκBα作為GC誘導(dǎo)的抗炎蛋白，也是MIF對抗GC抗炎作用的靶蛋白，我們的研究結(jié)果首次顯示Annexin 1可能也是MIF拮抗GC抗炎作用的關(guān)鍵蛋白。Annexin 1作為GC誘導(dǎo)的抗炎蛋白之一，其在胞漿內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的位置和MKP-1以及IκBα十分相似，都是信號通路中的上游蛋白。鑒于這三個(gè)細(xì)胞信號通路中的上游蛋白均在MIF負(fù)向調(diào)節(jié)GC抗炎作用的機(jī)制中扮演重要角色，因此通過增強(qiáng)其中一個(gè)蛋白的活性只能部分對抗MIF抵抗GC的作用，從而也說明了MIF在細(xì)胞內(nèi)作用的廣泛性和有效性。

本研究揭示了MIF負(fù)向調(diào)節(jié)GC抗炎作用的關(guān)鍵性分子是GC誘導(dǎo)的抗炎蛋白Annexin 1，即MIF通過干擾GC誘導(dǎo)Annexin 1的表達(dá)來對抗GC本身的抗炎作用。闡明這個(gè)分子機(jī)制，有助于更全面地了解GC不能有效發(fā)揮抗炎作用的原因，為臨床解釋某些炎癥性疾病存在的GC療效不滿意現(xiàn)象提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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