向志光，佟 巍，李雨函，劉先菊，張麗芳，王艷蓉，魏 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)中心，北京 100021)

我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)清潔級(jí)以上的嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行仙臺(tái)病毒檢測(cè)［1］，規(guī)定的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫熒光試驗(yàn)(IFA)等［2］。兩種方法分別以吸光度和熒光強(qiáng)度顯示特異性抗原抗體反應(yīng)，本質(zhì)相似。然而在實(shí)際應(yīng)用中部分樣品由于存在非特異結(jié)合，導(dǎo)致使用單一方法難以對(duì)這類(lèi)樣品做出準(zhǔn)確判斷。WB方法將病毒的抗原成分按照分子量進(jìn)行分離，可以更好的識(shí)別血清樣品中的特異結(jié)合，因此被美國(guó)Charles river等機(jī)構(gòu)用作可疑樣品的鑒定方法。

本研究在國(guó)內(nèi)首次對(duì)仙臺(tái)病毒使用WB方法進(jìn)行了抗原蛋白分析，確認(rèn)了仙臺(tái)病毒的特異性抗原。使用IFA、ELISA和 WB3種方法對(duì)無(wú)菌大鼠、SPF級(jí)大鼠以及清潔級(jí)大鼠血清樣品進(jìn)行測(cè)定，對(duì)3種方法的應(yīng)用進(jìn)行了比較。

1 材料和方法

1.1 WB的建立方法

仙臺(tái)病毒抗原蛋白純化方法參照本中心ELISA試劑盒制備抗原的方法［3］，制備常規(guī)12%聚丙烯凝膠，使用12道電泳槽(AE-6450，ATTO)，11道上樣仙臺(tái)病毒抗原蛋白10 μg，20 mA恒流電泳，至預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)(sm0671，F(xiàn)ermentas)達(dá)到預(yù)定位置。凝膠分離蛋白經(jīng)300 mA恒流轉(zhuǎn)移1 h至NC膜，將此膜固定于多道雜交器 (AE-6195，ATTO)，使預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)清晰展示于邊側(cè)一道。含有仙臺(tái)病毒抗原的11道，每道加入1∶100稀釋的大鼠血清樣品200 μL，稀釋液為含脫脂奶粉3%的PBST。4℃孵育過(guò)夜。PBST 3×10 min洗膜后，和HRP標(biāo)記的兔抗大鼠IgG抗體室溫雜交1 h。PBST 4×10 min洗膜后，經(jīng) ECL曝光顯影至乳膠片。

1.2 ELISA和IFA檢測(cè)方法

大鼠仙臺(tái)病毒ELISA抗體檢測(cè)方法參見(jiàn)本中心制備的小鼠仙臺(tái)病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法［3］，將酶標(biāo)記物變更為HRP標(biāo)記的兔抗大鼠IgG抗體。陰性上限判定值為陰性對(duì)照OD450讀值+0.15。IFA方法采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦方法［2］，以感染仙臺(tái)病毒的BHK-21細(xì)胞包被玻片，和1∶40稀釋的待檢血清樣品反應(yīng)，之后用熒光標(biāo)記物顯示特異結(jié)合，同時(shí)設(shè)BHK-21細(xì)胞對(duì)照，排除非特異結(jié)合的影響。

2 結(jié)果

2.1 仙臺(tái)病毒蛋白經(jīng)SDS-PAGE展示可顯示血清樣品中抗病毒抗體特異結(jié)合

經(jīng)差速離心分離的仙臺(tái)病毒經(jīng)超聲處理后和含SDS的上樣緩沖液混合處理后進(jìn)行凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移至NC膜上。和仙臺(tái)病毒抗體陰性的大鼠血清共孵育沒(méi)有特異性雜交(圖1A，N泳道);和仙臺(tái)病毒抗體陽(yáng)性的大鼠血清樣品共孵育顯示出特異條帶(圖1A，P泳道)，包括分子量70 ×103的條帶(箭頭a所示)和分子量57×103的條帶(箭頭b所示)。以此方法檢測(cè)待檢血清樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)菌大鼠血清和仙臺(tái)病毒無(wú)特異性雜交(圖1B，1～3泳道)，而來(lái)自清潔級(jí)的仙臺(tái)病毒抗體陽(yáng)性的大鼠血清(經(jīng)IFA方法證實(shí))可以和NC膜展示的仙臺(tái)病毒抗原特異性結(jié)合(圖1B，4～9泳道)，包含70×103和 57×103的特異條帶。

2.2 WB方法的敏感性

使用IFA、ELISA和WB3種方法檢測(cè)20份無(wú)菌大鼠血清樣品，均不能做出陽(yáng)性判斷(表1)。對(duì)227份SPF級(jí)大鼠血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，ELISA方法檢測(cè)3份陽(yáng)性樣品，其中2份經(jīng)WB檢測(cè)亦為陽(yáng)性，而以IFA方法檢測(cè)沒(méi)有樣品做出陽(yáng)性判斷。對(duì)63份清潔級(jí)大鼠血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，ELISA方法檢測(cè)出仙臺(tái)病毒抗體陽(yáng)性的樣品10份，而WB方法檢出仙臺(tái)病毒抗體陽(yáng)性樣品7份，IFA方法檢出仙臺(tái)病毒抗體陽(yáng)性樣品5份。ELISA、IFA和WB在普通環(huán)境大鼠檢出仙臺(tái)病毒抗體的陽(yáng)性率分別為為18.12%、11.34%和15.87%。

部分血清樣品使用IFA方法和WB檢測(cè)的結(jié)果如圖2所示。來(lái)自無(wú)菌大鼠的血清樣品(a)被IFA和WB方法均作出陰性判定;而仙臺(tái)病毒接種大鼠的血清(b)在IFA和 WB方法中均顯示為陽(yáng)性;來(lái)自清潔級(jí)大鼠血清c和d在WB方法中作出陽(yáng)性判定，而在IFA方法中樣品c做陽(yáng)性判定而d樣品做可疑判定;而部分 SPF大鼠樣品(e，f)，ELISA方法不能做陰性判定，在IFA方法中不能做陽(yáng)性判定，而在WB方法中卻被判定為可疑樣品。

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)推薦ELISA和IFA等血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒性病原體感染情況進(jìn)行檢測(cè)。理想的檢測(cè)方法應(yīng)能夠?qū)?dòng)物感染病毒的狀態(tài)做出判定，然而有諸多原因?qū)е卵鍖W(xué)檢測(cè)的不確定性:動(dòng)物感染病原體的窗口期抗病毒抗體的滴度低，普通方法難以檢測(cè);某些動(dòng)物罹患特殊疾病，自身抗體水平高，導(dǎo)致非特異反應(yīng)和較高的背景值;待檢樣品采集時(shí)存在溶血等情況而影響了樣品質(zhì)量;全病毒顆粒的不同抗原成分存在其他病原體的交叉抗原表位，病原體特異性抗原的純度低等。這些因素有些是可以控制的，比如血清樣品的采集質(zhì)量;而有些是所有方法都難以解決的，如動(dòng)物病毒感染的窗口期等。ELISA和IFA方法采用了的顏色反應(yīng)和熒光強(qiáng)度的判定，對(duì)于交叉抗原和特異抗原純度低的問(wèn)題難以解決，因此有必要使用其他方法對(duì)陽(yáng)性及可疑樣品進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1 仙臺(tái)病毒免疫印記檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)。Fig.1 The development of Western blot method for SeV detection．

表1 三種檢測(cè)方法對(duì)不同來(lái)源大鼠血清樣品的檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Results of rats sera from different facilities by 3 methods

圖2 不同來(lái)源大鼠血清IFA和WB檢測(cè)結(jié)果。Fig.2 The IFA(A)and WB(B)results of rat sera from different facilities．

仙臺(tái)病毒、小鼠肝炎病毒等是嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)常檢出的病毒性病原體。本文的研究表明仙臺(tái)病毒抗原經(jīng)SDS-PAGE按照分子量進(jìn)行分離，暴露了主要的抗原蛋白條帶如70 ×103和57 ×103的兩個(gè)抗原蛋白(圖1A)，符合仙臺(tái)病毒 HN抗原和NP 抗原的分子量大小，和文獻(xiàn)報(bào)道一致［4，5］。在WB的檢測(cè)方法中可以作為主要的判定標(biāo)準(zhǔn)。在ELISA和IFA兩種方法中由于抗原純度的限制而對(duì)某些感染情況難以判斷，但是在WB方法中可以較好的區(qū)分非特異雜交的背景和核心抗原條帶的雜交，如圖2B所示的樣品 d和 e，雖然存在一定的非特異背景，但是可以辨識(shí)出核心抗原條帶的陽(yáng)性雜交，因此可以判定為仙臺(tái)病毒可疑樣品。對(duì)于這些樣品，WB方法判定的準(zhǔn)確性要高于 ELISA和 IFA的方法。而對(duì)于任意一種方法檢測(cè)出的陽(yáng)性以及可疑樣品，對(duì)于采樣的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體來(lái)說(shuō)都需慎重處理:增加采樣量，采用不同方法以做出診斷無(wú)論對(duì)于繁育群體還是研究群體都是有重要意義的。

本文僅就仙臺(tái)病毒一種病毒性病原體比較分析了ELISA、IFA和WB方法的在檢測(cè)工作中的適用性，對(duì)于其他病毒的情況需要做進(jìn)一步的研究。

［1］ 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)，GB14922.2－2011．

［2］ 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 仙臺(tái)病毒檢測(cè)方法，GB/T 14926.23－2001．

［3］ 向志光，佟巍，劉先菊，等．小鼠仙臺(tái)病毒ELISA抗體檢測(cè)規(guī)范化試劑盒的研制與應(yīng)用［J］．中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2012，22(11)42－47．

［4］ Mizuguchi H，Nakanishi T，Kondoh M，et al．Fusion of Sendai virus with liposome depends on only F protein，but not HN protein［J］．Virus Research，1999，59:191 －201．

［5］ Ogino T，Iwama M，Kinouchi J，et al．Involvement of a Cellular Glycolytic Enzyme，Phosphoglycerate Kinase，in Sendai Virus Transcription［J］．Journal of Biological Chemistry，1999，274(50):35999－36008．