李 敏，馬蘭芝，白杰英，劉 一，趙彥斌，王洪寶，丁璐靜，武文卿，孫兆增，曾 林

(1．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，北京 100071;2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院科技部，北京 100850)

猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)又名猴艾滋病病毒，是猴獲得性免疫缺陷綜合征(simianaquiredimmunedeficiency syndrome，SAIDS)的致病病毒［1］。研究人員于1985年第一次從飼養(yǎng)的獼猴體內(nèi)分離到 SIV［2－4］。SIV感染主要破壞免疫系統(tǒng)，可導(dǎo)致細(xì)胞免疫和體液免疫缺陷。獼猴感染SIV可能會在其感染后期發(fā)展成為猴艾滋病(SAIDS)，SAIDS是一種慢性傳染病，致死率高，嚴(yán)重威脅猴群健康。因此，及時、準(zhǔn)確的檢測出SIV，并控制其傳播，對于猴群的健康及生產(chǎn)具有重要意義。

SIV與人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus，HIV)基因同源性高，其形態(tài)、理化特性、分子生物學(xué)特性和致病機(jī)制均與HIV十分相似［5］。SIV感染猴可以作為研究人類艾滋病的理想動物模型，用于艾滋病的各項研究［6，7］。在模型的構(gòu)建中，需檢測 SIV 的病毒水平來進(jìn)行評價。

衣殼蛋白 p27［8］，是 SIV病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其氨基酸序列高度保守，并含有誘導(dǎo)機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫的主要抗原決定簇，被認(rèn)為是SIV抗原檢測的標(biāo)志物［1］。因此，獲得 p27純化蛋白對SIV檢測方法的建立具有重要意義［9］。國內(nèi)已有利用 p27進(jìn)行檢測試劑盒的研究［10－12］，但目前還未見商品化的p27抗原檢測試劑盒的報道。

本研究利用基因合成方法，合成SIV衣殼蛋白p27的特異性抗原表位基因，成功構(gòu)建了 pMAL-p5x-p27重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)其在大腸桿菌中高效表達(dá)，并對所表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，以期為 SIV檢測試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)，表達(dá)載體 pMAL-p5x由本實驗室保存;限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA連接酶為寶生物公(TaKaRa)產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒為QIAGENE公司產(chǎn)品;PCR產(chǎn)物回收試劑盒為QIAGENE公司產(chǎn)品;DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)為康為世紀(jì)公司產(chǎn)品;蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為康為世紀(jì)公司產(chǎn)品;葡萄糖為國產(chǎn)分析純試劑;IPTG為進(jìn)口分析純試劑，Amylose Resin親和層析柱為NEB公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 基因合成

從GenBank上獲得SIV的p27基因序列，利用生物信息學(xué)軟件選擇衣殼蛋白p27抗原表位集中的區(qū)域，并在基因序列5‘和3’端分別添加 NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點;該基因片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成，合成序列全長753 bp，命名為p27。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將合成的含有p27基因的質(zhì)粒和表達(dá)載體質(zhì)粒pMAL-p5x同時用 NdeⅠ和 Eco RⅠ進(jìn)行雙酶切，回收雙酶切片段;用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMAL-p5x-p27;重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切鑒定，篩選陽性重組質(zhì)粒。

1.2.3 p27重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

取陽性單菌接種于含有氨芐及10 mmol/L葡萄糖的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)至至OD值為0.4～0.6，加入終濃度為0.3 mmol/L的 IPTG，30℃誘導(dǎo)4 h，離心收集菌體，進(jìn)行10%SDS-PAGE分析。

1.2.4 p27重組蛋白的純化

將1 L上述誘導(dǎo)后收集的表達(dá)菌體，用25 mL柱上樣緩沖液重懸，－20℃過夜，第2天將其溶化后，置于冰浴中進(jìn)行超聲破碎20 min(15 min(超聲5 s，間歇 15 s);4℃ 20000 r/min 離心 20 min，收集上清;采用 Amylose Resin親和層析柱純化目的蛋白，用包含10 mmol/L麥芽糖的上柱緩沖液進(jìn)行洗脫，收集純化蛋白，進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳分析。

2 結(jié)果

2.1 合成基因的鑒定

p27合成基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，PCR產(chǎn)物大小約為750 bp(見圖1)，與p27基因相符，證實合成基因正確。

圖1 p27 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳。Fig．1 Amplication of p27 DNA fragment by PCR．

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒用NdeⅠ和Eco RⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，可見約為5700 bp和750 bp2條DNA條帶(見圖2)，一條為 p27目的基因片段，約750 bp;另一條為pMAL-p5x載體基因片段，大小約為5700 bp。經(jīng)測序鑒定，目的基因序列與預(yù)期相符。

圖2 pMAL-p5x-p27重組質(zhì)粒的酶切鑒定。Fig．2 Restriction map of recombinant plasmid．

2.3 p27重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

pMAL-p5x-p27融合蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分析，可見約70×103的明顯條帶(見圖3)，與預(yù)期重組蛋白分子質(zhì)量大小一致。

2.4 p27重組蛋白的純化

誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)超聲波破碎獲得的上清用麥芽糖結(jié)合蛋白親和層析柱純化，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分析，可見獲得純的p27重組蛋白(見圖4)。

3 討論

選擇重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)時，需要考慮表達(dá)產(chǎn)物的產(chǎn)量、可溶性、純化效果等。本試驗選用可以高效融合表達(dá)的pMAL-p5x原核表達(dá)載體，這種載體系統(tǒng)可以產(chǎn)生麥芽糖結(jié)合蛋白融合的重組蛋白，增強(qiáng)了重組蛋白的可溶性。并且本試驗對誘導(dǎo)表達(dá)溫度、時間和 IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化，選擇用濃度為0.3 mmol/L IPTG在30℃低溫誘導(dǎo)4 h來增加蛋白的表達(dá)量和可溶性。試驗結(jié)果證明表達(dá)的p27融合蛋白表達(dá)量高，且多以可溶形式存在，為表達(dá)蛋白的純化提供了便利。本試驗采用麥芽糖結(jié)合蛋白親和層析柱純化方法，此法操作簡單、經(jīng)濟(jì)方便，純化效果好。經(jīng)純化獲得目的蛋白純度可達(dá)90%，純化獲得的p27融合蛋白為診斷試劑的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物的10%SDS-PAGE電泳。Fig．3 10%SDS－PAGE analysis of expressed products．

圖4 融合蛋白純化后的10%SDS－PAGE電泳。Fig．4 10%SDS － PAGE analysis of purified product．

SIV的衣殼蛋白 p27氨基酸序列比較保守［8］。利用p27抗原和p27抗體，可以在細(xì)胞和體液水平對SIV感染獼猴動物模型進(jìn)行研究，對艾滋病的相關(guān)機(jī)制研究、疫苗研發(fā)及其免疫策略有效性進(jìn)行評價［13］。因此，本試驗中我們選取SIV的p27基因來進(jìn)行研究。

本試驗根據(jù)NCBI已發(fā)表SIV p27基因序列，設(shè)計合成p27基因;應(yīng)用DNA重組技術(shù)，成功構(gòu)建出重組質(zhì)粒 pMAL-p5x-p27;完成了重組質(zhì)粒 pMAL-p5x-p27在大腸桿菌BL21(DE3)中的高效表達(dá)。綜上所述，本研究為SIV檢測試劑盒的研究及應(yīng)用奠定了一定基礎(chǔ)。

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