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        AC133抗原聯(lián)合EpCAM識(shí)別轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌干細(xì)胞的研究

        2013-11-27 01:20:46杜航向楊治力楊逸盛能全王志剛
        關(guān)鍵詞:血清實(shí)驗(yàn)能力

        杜航向 楊治力 楊逸 盛能全 王志剛

        結(jié)直腸癌是全球高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)病率不斷上升,在中國腫瘤死因中占第4位[1]。盡管結(jié)直腸癌的診療水平不斷提高,但術(shù)后復(fù)發(fā)率高,五年生存率低。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞亞群,在腫瘤中所占比例很?。?],被認(rèn)為是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源[3-6]。

        腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志分子是存在于腫瘤細(xì)胞表面的特異性蛋白分子,是腫瘤干細(xì)胞的身份象征,可被用來篩選腫瘤干細(xì)胞。最初AC133抗原被發(fā)現(xiàn)選擇性表達(dá)在人類胚胎的肝、骨髓、臍血及外周血CD+34造血細(xì)胞中[7],隨著研究進(jìn)展,在干細(xì)胞表面也發(fā)現(xiàn)有AC133抗原的表達(dá)。目前該抗原已被認(rèn)為是一個(gè)嶄新的、極有研究和應(yīng)用價(jià)值的干細(xì)胞表面標(biāo)志。

        最近,結(jié)直腸癌中也發(fā)現(xiàn)了上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)陽性的可疑腫瘤干細(xì)胞[8]。EpCAM是由GA-733-2基因編碼的相對分子質(zhì)量為40 000的糖蛋白,表達(dá)在人類大多數(shù)上皮細(xì)胞的基底側(cè),是最早被發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物之一。

        腫瘤干細(xì)胞理論的提出及證實(shí)[9-11],為惡性腫瘤的診斷和治療提供了新思路。近年來,腫瘤干細(xì)胞學(xué)說是腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域非常重要的研究進(jìn)展,該理論不但提供了腫瘤生成的可能原因,更解釋了腫瘤產(chǎn)生抗藥性導(dǎo)致難以治愈的可能原因。因此,對于各種腫瘤干細(xì)胞的鑒定及相關(guān)生物學(xué)理論的研究成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[12-15]。

        本研究嘗試以EpCAM和AC133為腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記,對結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后以流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選,從結(jié)直腸癌組織中分離出 AC133+EpCAM+結(jié)直腸癌干細(xì)胞,并對其進(jìn)行生物學(xué)鑒定,以期為結(jié)直腸癌干細(xì)胞的功能研究奠定基礎(chǔ)。

        資料與方法

        一、一般資料

        50例結(jié)腸腺癌組織標(biāo)本取自上海市第六人民醫(yī)院普外科2012年6月至8月間接收手術(shù)治療的結(jié)腸癌患者。其中,男性33例,女性17例;年齡41~83歲(中位年齡62歲)。術(shù)中冰凍切片及術(shù)后病理切片均證實(shí)為腺癌組織。術(shù)前術(shù)后未經(jīng)過任何化療藥物干擾。組織獲取均經(jīng)過患者同意,并通過醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

        二、方法

        1.主要試劑:藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的AC133單抗(德國 Miltenyi Bio-tec公司),異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的 EpCAM抗體(美國 Ebioscience公司),DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司),堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)(美國 Peprotech公司),DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)。

        2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:Balb/C裸鼠30只均購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,4~6周齡,體重15~20 g,雌雄不限,在無特殊病原體動(dòng)物飼養(yǎng)室喂養(yǎng)。常規(guī)飼料喂飼和飲水。

        3.腫瘤組織取材:取新鮮結(jié)腸癌患者手術(shù)后標(biāo)本,0.9%生理鹽水沖洗后切取腫瘤邊緣約1 cm×2 cm大小的非壞死組織。用清洗液(青霉素1 mg/ml、卡那霉素 0.5 mg/ml、兩性霉素 2.5 ug/ml的生理鹽水)清洗癌組織5次,4℃保存液中保存?zhèn)溆谩?/p>

        4.原代結(jié)腸癌細(xì)胞提取:在無菌條件下,用細(xì)胞清洗液清洗腫瘤組織3次,將其剪碎后用9 ml清洗液清洗后收集到50 ml離心管中,加入0.25%分散酶 1.5 ml、0.4% 膠原酶 0.5 ml胎牛血清(FSC)50 ul,放入37℃培養(yǎng)箱中振蕩消化1 h。離心后用60目篩網(wǎng)過濾,收集,再次離心后的組織與10 ml培養(yǎng)液混勻后放入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中過夜培養(yǎng)。第二天將上清懸浮細(xì)胞吸除,保留貼壁活性細(xì)胞。胰酶消化后用120目篩網(wǎng)過濾,計(jì)數(shù)后備用。

        5.流式細(xì)胞術(shù)分選:取上述制備好的單細(xì)胞懸液1×106個(gè)/ml,加入20 ul PE標(biāo)記的AC133抗體、80 ul FITC標(biāo)記的 EpCAM抗體,4℃避光孵育30 min,用PBS漂洗后,用流式細(xì)胞儀分選AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞,收集待用,采用WinMDI 2.9軟件分析流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)。

        6.細(xì)胞的體外培養(yǎng)和形態(tài)觀察:將 AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代培養(yǎng),用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況并拍照。

        7.體外克隆形成實(shí)驗(yàn):取對數(shù)生長期AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞,0.25% 胰酶消化并吹打成為單細(xì)胞,用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/L,然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋;用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%兩個(gè)濃度的低熔點(diǎn)瓊脂糖液,高壓滅菌,維持在40℃確保不凝;按1:1比例使1.2%的瓊脂糖液和2×DMEM培養(yǎng)基(含2×抗生素和20%小牛血清)混勻后,取3 ml混合液注入到直徑6 cm的平皿中,冷卻凝固,待用;按1:1比例使0.7%的瓊脂糖液和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中混勻,再向管中加入0.2 ml的細(xì)胞懸液,充分混勻,注入待用的平皿中,形成雙瓊脂層,待上層瓊脂凝固后,置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10~14 d;把平皿放在倒置顯微鏡下,觀察細(xì)胞克隆數(shù),計(jì)算形成率。

        8.多細(xì)胞球培養(yǎng):取對數(shù)生長期的 AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞,0.25% 胰酶消化后輕輕吹打,使之成為單細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)基重懸,計(jì)數(shù)后,以小于104/ml密度接種至無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng);細(xì)胞培養(yǎng)液加入至T25或更小的玻璃培養(yǎng)瓶中,豎直放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),每2~3天半量換液,每6~8天傳代一次;傳代時(shí)離心收集微球體,重懸于胰酶替代品Accutase液中,37℃消化5~10 min,吹打數(shù)次至使之成為單細(xì)胞,離心洗滌后計(jì)數(shù),種至無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

        9.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn):在裸鼠腋下將處于對數(shù)生長期的AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞及其微球體細(xì)胞分別以3 ×103、3 ×104、3 ×105皮下接種,每3天觀察一次腫瘤形成情況,連續(xù)觀察4周后,處死小鼠取出腫瘤組織并測量其大小。

        10.Transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):將無血清培養(yǎng)液和Matrigel膠按2.5:1的比例混合均勻后包被到Transwell小室底部;取對數(shù)生長期的 AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞及其微球體細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×104,加至小室,用含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);小室外加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基;每組細(xì)胞重復(fù)3次,常規(guī)培養(yǎng)48 h后取出小室,擦去微孔膜上層細(xì)胞后,蘇木素染色,顯微鏡觀察微孔膜下層的細(xì)胞并計(jì)數(shù);計(jì)算相對侵襲指數(shù)(V2/V1,其中 V1代表AC133+EpCAM+細(xì)胞或AC133-EpCAM-細(xì)胞的穿膜數(shù),V2代表其微球體細(xì)胞的穿膜數(shù))。

        11.CCK-8法檢測體外增殖力:AC133+EpCAM+及AC133-EpCAM-組細(xì)胞重懸于含EGF及bFGF的ATCC中,稀釋為1x104/ml,以每孔200 uL接種于96孔板.共設(shè)1個(gè)空白對照組(無細(xì)胞的ATCC)和7個(gè)測定組。將接種好的96孔板進(jìn)行培養(yǎng),每間隔24 h以CCK-8法測定。以空白對照組調(diào)零,用酶聯(lián)免疫檢測儀于450 nm處測定各孔吸光度值,每種細(xì)胞每次測定3孔,取其平均值。以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo),平均吸光度值為縱坐標(biāo),描繪細(xì)胞生長曲線。

        三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,兩組間比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1.AC133+EpCAM+細(xì)胞較 AC133-EpCAM-細(xì)胞表現(xiàn)出更好的折光性,細(xì)胞團(tuán)直徑更大,密度更高(圖1)。

        圖1 AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞體外培養(yǎng)倒置相差顯微鏡觀察圖像

        2.AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果:AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞在相同條件下前者較后者形成了更多的克隆細(xì)胞團(tuán),直徑更大,密度更高(圖2)。

        3.AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞微球體形成情況:培養(yǎng)24 h的細(xì)胞呈懸浮狀態(tài),有較小的細(xì)胞團(tuán)塊出現(xiàn);3 d后可見大部分細(xì)胞呈碎渣樣死亡,少數(shù)細(xì)胞成團(tuán)長大,形態(tài)規(guī)則;6~8 d后可見到由數(shù)十到數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成較大的圓形或卵圓形細(xì)胞微球體,致密均一,折光性良好,懸浮生長。傳代培養(yǎng)后可見微球體的形成增多且形態(tài)趨于圓形(圖3)。

        4.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果:AC133+EpCAM+結(jié)直腸癌干細(xì)胞具有很強(qiáng)致瘤性,100個(gè)AC133+EpCAM+結(jié)腸癌干細(xì)胞就能形成移植瘤,隨著細(xì)胞數(shù)目的增多,成瘤率逐漸增高,腫瘤的直徑增大;而AC133-EpCAM-細(xì)胞的成瘤能力相對很弱(圖4,表1)。

        圖2 AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)平皿在倒置顯微鏡下觀察圖像

        圖3 AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞經(jīng)多細(xì)胞球培養(yǎng)后倒置相差顯微鏡下觀察圖像

        圖4 接種AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞的裸鼠腫瘤標(biāo)本圖像

        5.AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞及其微球體的侵襲能力(圖5):從圖中可知,AC133+EpCAM+細(xì)胞表現(xiàn)出最強(qiáng)的侵襲能力,AC133-EpCAM-細(xì)胞最弱。

        6.體外增殖能力檢測:利用 CCK-8法檢測AC133+EpCAM+和AC133-EpCAM-細(xì)胞體外增殖能力并繪制細(xì)胞生長曲線。AC133+EpCAM+組較AC133-EpCAM-組生長迅速.AC133+EpCAM+組細(xì)胞群體倍增時(shí)間為(20±2)h,而AC133-EpCAM-組細(xì)胞群體倍增時(shí)間為(42±5)h.兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05,圖6)。

        討 論

        目前研究表明,只有極小部分腫瘤干細(xì)胞具有成瘤能力,且成瘤率較高[16-19]。如何找到一種簡單有效的方法,準(zhǔn)確地確定這類干細(xì)胞,一直是科學(xué)家不斷探索的課題。由于腫瘤干細(xì)胞是無特異生理功能的未分化細(xì)胞,因此檢測其特異性表面標(biāo)記就成為一種分選與鑒定干細(xì)胞的重要方法。

        圖5 AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞及其微球體微孔膜下層顯微鏡觀察圖像

        表1 Balb-C裸鼠成瘤率的比較

        圖6 AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞體外增殖能力生長曲線圖

        自我更新是干細(xì)胞的重要特性,體外培養(yǎng)的細(xì)胞常用克隆形成實(shí)驗(yàn)來檢測干細(xì)胞的自我更新能力。腫瘤干細(xì)胞能在無血清添加的重組表皮生長因子和堿性成纖維生長因子培養(yǎng)基中懸浮生長,形成“細(xì)胞球”樣結(jié)構(gòu),并且具有無限增殖的潛能,可在體外連續(xù)傳代并不影響細(xì)胞球的結(jié)構(gòu)。這種細(xì)胞球可反映實(shí)體腫瘤的立體生長方式和組織結(jié)構(gòu),并且可準(zhǔn)確模仿腫瘤內(nèi)的細(xì)胞間聯(lián)系和微環(huán)境條件,特別是營養(yǎng)和氧濃度梯度[20]。2007 年,O’Brien等[21]首先報(bào)道了結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞存在于CD133+細(xì)胞群中,CD133+細(xì)胞群除了能在體外無血清培養(yǎng)基中以未分化腫瘤細(xì)胞球的形式快速增長,還能在免疫缺陷小鼠體內(nèi)連續(xù)成瘤。因此,腫瘤干細(xì)胞能在無血清培養(yǎng)基中生長并形成細(xì)胞球是自我更新能力的體現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中,EpCAM+AC133+細(xì)胞能在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長,3周后能形成均勻一致的細(xì)胞球。而且在血清誘導(dǎo)下,結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物 AC133、EpCAM的表達(dá)逐漸減少,EpCAM+AC133+細(xì)胞比例逐漸下降,培養(yǎng)7 d后,失去懸浮生長能力,貼壁生長,表明其在體外培養(yǎng)后,產(chǎn)生了不同表型的子代細(xì)胞,僅一部分細(xì)胞保持了與母代細(xì)胞相似的表型和特性,這一部分細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)條件下仍然具有形成克隆的能力,表明EpCAM+AC133+細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)仍具有分化與自我更新的能力。

        腫瘤干細(xì)胞有表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志、啟動(dòng)腫瘤發(fā)生和腫瘤形成的能力。Oliver等[22]認(rèn)為僅需一個(gè)腫瘤細(xì)胞就能在體內(nèi)復(fù)制出其來源組織的腫瘤。Al-Hajj等[23]證明只需100個(gè)表面抗原為 CD44+CD24-的乳腺癌細(xì)胞即可在NOD/SCID鼠體內(nèi)形成移植瘤。這種能力與腫瘤干細(xì)胞自我更新分化及增殖能力有關(guān),也是鑒定腫瘤干細(xì)胞最重要的環(huán)節(jié)。在本實(shí)驗(yàn)中,我們將分選后的EpCAM+AC133+細(xì)胞與EpCAM-AC133-細(xì)胞以不同濃度分別接種于NOD/SCID小鼠皮下觀察其形成移植瘤的能力,以評(píng)價(jià)其致瘤性的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EpCAM+AC133+細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力明顯強(qiáng)于EpCAM-AC133-細(xì)胞(P<0.01),即使接種數(shù)少至100個(gè)細(xì)胞,也有40%的成瘤率,但成瘤時(shí)間較長,腫瘤也較小,接種數(shù)為5 000個(gè)細(xì)胞時(shí)則全部成瘤,成瘤時(shí)間明顯縮短,瘤體較大,而EpCAM-AC133-細(xì)胞即使接種數(shù)為10 000個(gè)細(xì)胞也不能成瘤。另外,EpCAM+AC133+細(xì)胞的成瘤能力也強(qiáng)于未分選的細(xì)胞,即使接種10 000個(gè)未分選細(xì)胞,也僅有20%的成瘤率,低于接種100個(gè)EpCAM+AC133+細(xì)胞的成瘤率(40%),接說明腫瘤干細(xì)胞的比例是很低的。這顯示EpCAM+AC133+有較強(qiáng)的致瘤能力,是結(jié)直腸癌的主要致瘤細(xì)胞,具有腫瘤干細(xì)胞的特性。

        AC133是乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、肝癌、前列腺癌等多種實(shí)體瘤的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物[24-25]。通過對CD133+結(jié)直腸癌細(xì)胞的分選和體外擴(kuò)增,我們發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增的CD133+結(jié)直腸癌細(xì)胞具有類似神經(jīng)干細(xì)胞球的生長特性,并有多向分化及自我更新能力;更為重要的是AC133+結(jié)直腸癌細(xì)胞較AC133-結(jié)直腸癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤能力。該研究為AC133作為結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)記物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為了使分選的結(jié)直腸腺癌干細(xì)胞更加純凈,我們在實(shí)驗(yàn)中增加了特異性的EpCAM分子作為分選標(biāo)記,而且在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了AC133陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)EpCAM分子。

        腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是臨床上腫瘤得不到根治的一個(gè)重要原因,它是腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)之間一系列復(fù)雜的、多步驟、多因素影響的過程,侵襲是整個(gè)過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干細(xì)胞球的黏附性和侵襲性明顯強(qiáng)于親本細(xì)胞,從而解釋了為什么腫瘤干細(xì)胞會(huì)成為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。

        通過本研究不僅對人結(jié)直腸腺癌干細(xì)胞的鑒定和流式分選建立了技術(shù)平臺(tái),更重要的是為后續(xù)研究人結(jié)直腸癌干細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)特性提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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