杜航向 楊治力 楊逸 盛能全 王志剛

結(jié)直腸癌是全球高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率不斷上升，在中國腫瘤死因中占第4位［1］。盡管結(jié)直腸癌的診療水平不斷提高，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，五年生存率低。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞中具有自我更新和多向分化能力的細(xì)胞亞群，在腫瘤中所占比例很?。?］，被認(rèn)為是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源［3-6］。

腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志分子是存在于腫瘤細(xì)胞表面的特異性蛋白分子，是腫瘤干細(xì)胞的身份象征，可被用來篩選腫瘤干細(xì)胞。最初AC133抗原被發(fā)現(xiàn)選擇性表達(dá)在人類胚胎的肝、骨髓、臍血及外周血CD+34造血細(xì)胞中［7］，隨著研究進(jìn)展，在干細(xì)胞表面也發(fā)現(xiàn)有AC133抗原的表達(dá)。目前該抗原已被認(rèn)為是一個(gè)嶄新的、極有研究和應(yīng)用價(jià)值的干細(xì)胞表面標(biāo)志。

最近，結(jié)直腸癌中也發(fā)現(xiàn)了上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)陽性的可疑腫瘤干細(xì)胞［8］。EpCAM是由GA-733-2基因編碼的相對分子質(zhì)量為40 000的糖蛋白，表達(dá)在人類大多數(shù)上皮細(xì)胞的基底側(cè)，是最早被發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物之一。

腫瘤干細(xì)胞理論的提出及證實(shí)［9-11］，為惡性腫瘤的診斷和治療提供了新思路。近年來，腫瘤干細(xì)胞學(xué)說是腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域非常重要的研究進(jìn)展，該理論不但提供了腫瘤生成的可能原因，更解釋了腫瘤產(chǎn)生抗藥性導(dǎo)致難以治愈的可能原因。因此，對于各種腫瘤干細(xì)胞的鑒定及相關(guān)生物學(xué)理論的研究成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［12-15］。

本研究嘗試以EpCAM和AC133為腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記，對結(jié)直腸癌細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記后以流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，從結(jié)直腸癌組織中分離出 AC133+EpCAM+結(jié)直腸癌干細(xì)胞，并對其進(jìn)行生物學(xué)鑒定，以期為結(jié)直腸癌干細(xì)胞的功能研究奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

一、一般資料

50例結(jié)腸腺癌組織標(biāo)本取自上海市第六人民醫(yī)院普外科2012年6月至8月間接收手術(shù)治療的結(jié)腸癌患者。其中，男性33例，女性17例;年齡41～83歲(中位年齡62歲)。術(shù)中冰凍切片及術(shù)后病理切片均證實(shí)為腺癌組織。術(shù)前術(shù)后未經(jīng)過任何化療藥物干擾。組織獲取均經(jīng)過患者同意，并通過醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方法

1．主要試劑:藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的AC133單抗(德國 Miltenyi Bio-tec公司)，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的 EpCAM抗體(美國 Ebioscience公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)(美國 Peprotech公司)，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)。

2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:Balb/C裸鼠30只均購自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，4～6周齡，體重15～20 g，雌雄不限，在無特殊病原體動(dòng)物飼養(yǎng)室喂養(yǎng)。常規(guī)飼料喂飼和飲水。

3．腫瘤組織取材:取新鮮結(jié)腸癌患者手術(shù)后標(biāo)本，0．9%生理鹽水沖洗后切取腫瘤邊緣約1 cm×2 cm大小的非壞死組織。用清洗液(青霉素1 mg/ml、卡那霉素 0．5 mg/ml、兩性霉素 2．5 ug/ml的生理鹽水)清洗癌組織5次，4℃保存液中保存?zhèn)溆谩?/p>

4．原代結(jié)腸癌細(xì)胞提取:在無菌條件下，用細(xì)胞清洗液清洗腫瘤組織3次，將其剪碎后用9 ml清洗液清洗后收集到50 ml離心管中，加入0．25%分散酶 1．5 ml、0．4% 膠原酶 0．5 ml胎牛血清(FSC)50 ul，放入37℃培養(yǎng)箱中振蕩消化1 h。離心后用60目篩網(wǎng)過濾，收集，再次離心后的組織與10 ml培養(yǎng)液混勻后放入25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中過夜培養(yǎng)。第二天將上清懸浮細(xì)胞吸除，保留貼壁活性細(xì)胞。胰酶消化后用120目篩網(wǎng)過濾，計(jì)數(shù)后備用。

5．流式細(xì)胞術(shù)分選:取上述制備好的單細(xì)胞懸液1×106個(gè)/ml，加入20 ul PE標(biāo)記的AC133抗體、80 ul FITC標(biāo)記的 EpCAM抗體，4℃避光孵育30 min，用PBS漂洗后，用流式細(xì)胞儀分選AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞，收集待用，采用WinMDI 2．9軟件分析流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)。

6．細(xì)胞的體外培養(yǎng)和形態(tài)觀察:將 AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基上進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況并拍照。

7．體外克隆形成實(shí)驗(yàn):取對數(shù)生長期AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞，0．25% 胰酶消化并吹打成為單細(xì)胞，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/L，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求作梯度倍數(shù)稀釋;用蒸餾水分別制備出1．2%和0．7%兩個(gè)濃度的低熔點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌，維持在40℃確保不凝;按1:1比例使1．2%的瓊脂糖液和2×DMEM培養(yǎng)基(含2×抗生素和20%小牛血清)混勻后，取3 ml混合液注入到直徑6 cm的平皿中，冷卻凝固，待用;按1:1比例使0．7%的瓊脂糖液和2×DMEM培養(yǎng)基在無菌試管中混勻，再向管中加入0．2 ml的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入待用的平皿中，形成雙瓊脂層，待上層瓊脂凝固后，置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d;把平皿放在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算形成率。

8．多細(xì)胞球培養(yǎng):取對數(shù)生長期的 AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞，0．25% 胰酶消化后輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)后，以小于104/ml密度接種至無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng);細(xì)胞培養(yǎng)液加入至T25或更小的玻璃培養(yǎng)瓶中，豎直放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2～3天半量換液，每6～8天傳代一次;傳代時(shí)離心收集微球體，重懸于胰酶替代品Accutase液中，37℃消化5～10 min，吹打數(shù)次至使之成為單細(xì)胞，離心洗滌后計(jì)數(shù)，種至無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

9．裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn):在裸鼠腋下將處于對數(shù)生長期的AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞及其微球體細(xì)胞分別以3 ×103、3 ×104、3 ×105皮下接種，每3天觀察一次腫瘤形成情況，連續(xù)觀察4周后，處死小鼠取出腫瘤組織并測量其大小。

10．Transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):將無血清培養(yǎng)液和Matrigel膠按2．5:1的比例混合均勻后包被到Transwell小室底部;取對數(shù)生長期的 AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞及其微球體細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)整至1×104，加至小室，用含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);小室外加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基;每組細(xì)胞重復(fù)3次，常規(guī)培養(yǎng)48 h后取出小室，擦去微孔膜上層細(xì)胞后，蘇木素染色，顯微鏡觀察微孔膜下層的細(xì)胞并計(jì)數(shù);計(jì)算相對侵襲指數(shù)(V2/V1，其中 V1代表AC133+EpCAM+細(xì)胞或AC133-EpCAM-細(xì)胞的穿膜數(shù)，V2代表其微球體細(xì)胞的穿膜數(shù))。

11．CCK-8法檢測體外增殖力:AC133+EpCAM+及AC133-EpCAM-組細(xì)胞重懸于含EGF及bFGF的ATCC中，稀釋為1x104/ml，以每孔200 uL接種于96孔板．共設(shè)1個(gè)空白對照組(無細(xì)胞的ATCC)和7個(gè)測定組。將接種好的96孔板進(jìn)行培養(yǎng)，每間隔24 h以CCK-8法測定。以空白對照組調(diào)零，用酶聯(lián)免疫檢測儀于450 nm處測定各孔吸光度值，每種細(xì)胞每次測定3孔，取其平均值。以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，平均吸光度值為縱坐標(biāo)，描繪細(xì)胞生長曲線。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS11．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．AC133+EpCAM+細(xì)胞較 AC133-EpCAM-細(xì)胞表現(xiàn)出更好的折光性，細(xì)胞團(tuán)直徑更大，密度更高(圖1)。

圖1 AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞體外培養(yǎng)倒置相差顯微鏡觀察圖像

2．AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果:AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞在相同條件下前者較后者形成了更多的克隆細(xì)胞團(tuán)，直徑更大，密度更高(圖2)。

3．AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞微球體形成情況:培養(yǎng)24 h的細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，有較小的細(xì)胞團(tuán)塊出現(xiàn);3 d后可見大部分細(xì)胞呈碎渣樣死亡，少數(shù)細(xì)胞成團(tuán)長大，形態(tài)規(guī)則;6～8 d后可見到由數(shù)十到數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成較大的圓形或卵圓形細(xì)胞微球體，致密均一，折光性良好，懸浮生長。傳代培養(yǎng)后可見微球體的形成增多且形態(tài)趨于圓形(圖3)。

4．裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果:AC133+EpCAM+結(jié)直腸癌干細(xì)胞具有很強(qiáng)致瘤性，100個(gè)AC133+EpCAM+結(jié)腸癌干細(xì)胞就能形成移植瘤，隨著細(xì)胞數(shù)目的增多，成瘤率逐漸增高，腫瘤的直徑增大;而AC133-EpCAM-細(xì)胞的成瘤能力相對很弱(圖4，表1)。

圖2 AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)平皿在倒置顯微鏡下觀察圖像

圖3 AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞經(jīng)多細(xì)胞球培養(yǎng)后倒置相差顯微鏡下觀察圖像

圖4 接種AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133－EpCAM－細(xì)胞的裸鼠腫瘤標(biāo)本圖像

5．AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133-EpCAM-細(xì)胞及其微球體的侵襲能力(圖5):從圖中可知，AC133+EpCAM+細(xì)胞表現(xiàn)出最強(qiáng)的侵襲能力，AC133-EpCAM-細(xì)胞最弱。

6．體外增殖能力檢測:利用 CCK-8法檢測AC133+EpCAM+和AC133-EpCAM-細(xì)胞體外增殖能力并繪制細(xì)胞生長曲線。AC133+EpCAM+組較AC133-EpCAM-組生長迅速．AC133+EpCAM+組細(xì)胞群體倍增時(shí)間為(20±2)h，而AC133-EpCAM-組細(xì)胞群體倍增時(shí)間為(42±5)h．兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05，圖6)。

討 論

目前研究表明，只有極小部分腫瘤干細(xì)胞具有成瘤能力，且成瘤率較高［16-19］。如何找到一種簡單有效的方法，準(zhǔn)確地確定這類干細(xì)胞，一直是科學(xué)家不斷探索的課題。由于腫瘤干細(xì)胞是無特異生理功能的未分化細(xì)胞，因此檢測其特異性表面標(biāo)記就成為一種分選與鑒定干細(xì)胞的重要方法。

圖5 AC133+EpCAM+細(xì)胞和AC133-EpCAM-細(xì)胞及其微球體微孔膜下層顯微鏡觀察圖像

表1 Balb-C裸鼠成瘤率的比較

圖6 AC133+EpCAM+細(xì)胞和 AC133－EpCAM－細(xì)胞體外增殖能力生長曲線圖

自我更新是干細(xì)胞的重要特性，體外培養(yǎng)的細(xì)胞常用克隆形成實(shí)驗(yàn)來檢測干細(xì)胞的自我更新能力。腫瘤干細(xì)胞能在無血清添加的重組表皮生長因子和堿性成纖維生長因子培養(yǎng)基中懸浮生長，形成“細(xì)胞球”樣結(jié)構(gòu)，并且具有無限增殖的潛能，可在體外連續(xù)傳代并不影響細(xì)胞球的結(jié)構(gòu)。這種細(xì)胞球可反映實(shí)體腫瘤的立體生長方式和組織結(jié)構(gòu)，并且可準(zhǔn)確模仿腫瘤內(nèi)的細(xì)胞間聯(lián)系和微環(huán)境條件，特別是營養(yǎng)和氧濃度梯度［20］。2007 年，O’Brien等［21］首先報(bào)道了結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞存在于CD133+細(xì)胞群中，CD133+細(xì)胞群除了能在體外無血清培養(yǎng)基中以未分化腫瘤細(xì)胞球的形式快速增長，還能在免疫缺陷小鼠體內(nèi)連續(xù)成瘤。因此，腫瘤干細(xì)胞能在無血清培養(yǎng)基中生長并形成細(xì)胞球是自我更新能力的體現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)中，EpCAM+AC133+細(xì)胞能在無血清培養(yǎng)基中懸浮生長，3周后能形成均勻一致的細(xì)胞球。而且在血清誘導(dǎo)下，結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物 AC133、EpCAM的表達(dá)逐漸減少，EpCAM+AC133+細(xì)胞比例逐漸下降，培養(yǎng)7 d后，失去懸浮生長能力，貼壁生長，表明其在體外培養(yǎng)后，產(chǎn)生了不同表型的子代細(xì)胞，僅一部分細(xì)胞保持了與母代細(xì)胞相似的表型和特性，這一部分細(xì)胞在干細(xì)胞培養(yǎng)條件下仍然具有形成克隆的能力，表明EpCAM+AC133+細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)仍具有分化與自我更新的能力。

腫瘤干細(xì)胞有表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志、啟動(dòng)腫瘤發(fā)生和腫瘤形成的能力。Oliver等［22］認(rèn)為僅需一個(gè)腫瘤細(xì)胞就能在體內(nèi)復(fù)制出其來源組織的腫瘤。Al-Hajj等［23］證明只需100個(gè)表面抗原為 CD44+CD24-的乳腺癌細(xì)胞即可在NOD/SCID鼠體內(nèi)形成移植瘤。這種能力與腫瘤干細(xì)胞自我更新分化及增殖能力有關(guān)，也是鑒定腫瘤干細(xì)胞最重要的環(huán)節(jié)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將分選后的EpCAM+AC133+細(xì)胞與EpCAM-AC133-細(xì)胞以不同濃度分別接種于NOD/SCID小鼠皮下觀察其形成移植瘤的能力，以評(píng)價(jià)其致瘤性的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EpCAM+AC133+細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力明顯強(qiáng)于EpCAM-AC133-細(xì)胞(P＜0．01)，即使接種數(shù)少至100個(gè)細(xì)胞，也有40%的成瘤率，但成瘤時(shí)間較長，腫瘤也較小，接種數(shù)為5 000個(gè)細(xì)胞時(shí)則全部成瘤，成瘤時(shí)間明顯縮短，瘤體較大，而EpCAM-AC133-細(xì)胞即使接種數(shù)為10 000個(gè)細(xì)胞也不能成瘤。另外，EpCAM+AC133+細(xì)胞的成瘤能力也強(qiáng)于未分選的細(xì)胞，即使接種10 000個(gè)未分選細(xì)胞，也僅有20%的成瘤率，低于接種100個(gè)EpCAM+AC133+細(xì)胞的成瘤率(40%)，接說明腫瘤干細(xì)胞的比例是很低的。這顯示EpCAM+AC133+有較強(qiáng)的致瘤能力，是結(jié)直腸癌的主要致瘤細(xì)胞，具有腫瘤干細(xì)胞的特性。

AC133是乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、肝癌、前列腺癌等多種實(shí)體瘤的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物［24-25］。通過對CD133+結(jié)直腸癌細(xì)胞的分選和體外擴(kuò)增，我們發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增的CD133+結(jié)直腸癌細(xì)胞具有類似神經(jīng)干細(xì)胞球的生長特性，并有多向分化及自我更新能力;更為重要的是AC133+結(jié)直腸癌細(xì)胞較AC133-結(jié)直腸癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤能力。該研究為AC133作為結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)記物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為了使分選的結(jié)直腸腺癌干細(xì)胞更加純凈，我們在實(shí)驗(yàn)中增加了特異性的EpCAM分子作為分選標(biāo)記，而且在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了AC133陽性細(xì)胞同時(shí)表達(dá)EpCAM分子。

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是臨床上腫瘤得不到根治的一個(gè)重要原因，它是腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)之間一系列復(fù)雜的、多步驟、多因素影響的過程，侵襲是整個(gè)過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明干細(xì)胞球的黏附性和侵襲性明顯強(qiáng)于親本細(xì)胞，從而解釋了為什么腫瘤干細(xì)胞會(huì)成為腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。

通過本研究不僅對人結(jié)直腸腺癌干細(xì)胞的鑒定和流式分選建立了技術(shù)平臺(tái)，更重要的是為后續(xù)研究人結(jié)直腸癌干細(xì)胞的相關(guān)生物學(xué)特性提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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