聞 靜 趙 剛 焦 丹 王建華 王曉丹 王國政 時(shí)曉杰**

(1．黑河出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江黑河 164300；2. 黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局漠河辦事處，黑龍江漠河 165300)

蜱是攜帶及傳播病原體較多的一種媒介生物，其攜帶的病原體大多數(shù)都可引起自然疫源性疾病和人獸共患病，如森林腦炎、萊姆病、立克次體病、土拉菌病等(高志華和劉敬澤, 2003)。近年來，一些新發(fā)或再度肆虐的蜱媒疾病對人畜的危害日趨嚴(yán)重，如嗜吞噬細(xì)胞無形體病、人巴貝西原蟲病、新立克次體病等在局部地區(qū)流行(Sunetal.，2008；宋鋒林等，2011)，引起了公共衛(wèi)生部門的高度重視，黑河地區(qū)與俄羅斯接壤，是我國對俄羅斯貿(mào)易的重要口岸，也是一些蜱媒疾病如萊姆病(付維明等，2009)、立克次體病(孫秀峰等，2007)等蜱傳疾病的疫區(qū)之一。加強(qiáng)對該地區(qū)的衛(wèi)生監(jiān)督、有效的診斷及溯源蜱傳疾病對該區(qū)域的影響是預(yù)防國境口岸重要傳染病發(fā)生及生物恐怖事件的基礎(chǔ)。為此，本文于中俄邊境黑河口岸地區(qū)采集蜱類，并開展蜱傳病原體監(jiān)測研究，為明確該地區(qū)的蜱媒病原本底，提升口岸檢驗(yàn)檢疫能力奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1蜱類采集：2012年4月16日至10月8日期間每個月分別在上旬及下旬進(jìn)行兩次蜱蟲采集，采用布旗法在黑河、遜克、孫吳及漠河地區(qū)(表1)進(jìn)行蜱蟲采集，采集到731只蜱(森林革蜱Dermacentorsilvarum686只、嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna36只、全溝硬蜱Ixodespersulcatus9只)分成95組(除漠河的森林革蜱每組10只，全溝硬蜱每組9只其余均每組7～8只)進(jìn)行病原體檢測。

表1 蜱的采集地點(diǎn)及生境描述Tab.1 The description of the sample sites and habitat

1.1.2試劑：Taq酶、AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA提取試劑盒及基因組DNA提取試劑盒均購自Promega公司，大腸桿菌DH5α、dNTPs、DL2000 DNA marker、T載體均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方法

1.2.1基因組提取：基因組DNA及總RNA的提取在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，每只蜱用75%酒精浸泡3～5 min，用無菌的雙蒸水沖洗3次，7～8只一組分裝在EP管內(nèi)，利用組織破碎儀50/s振動破碎3 min，按照試劑盒說明書提取基因組DNA及RNA。

1.2.2PCR擴(kuò)增檢測：以提取的DNA為模板，按照表2列出的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用于檢測伯氏螺旋體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、立克次體(屬)、土拉菌、巴貝西蟲、查菲埃里克體。擴(kuò)增反應(yīng)體系包括Taq 酶1.25 U，10 ×PCR buffer 5 μL，dNTPs mixture 0.2 μmol/L，上下游引物0.5 μmol/L，模板DNA 約為0.5 μg，補(bǔ)充無菌水使總體積達(dá)到25 μL。94℃預(yù)變性5 min，然后按照表1列出擴(kuò)增條件PCR循環(huán)，最后72℃延伸5 min。每檢測組設(shè)一例陰性對照，反應(yīng)體系同上，以DEPC處理過的水代替DNA模板。擴(kuò)增到的片段經(jīng)過膠回收后與 pMD-18T載體連接后送北京三博遠(yuǎn)志測序部進(jìn)行測序。每組陽性率按照最小概率計(jì)算即一組陽性按照一只蜱攜帶病原體計(jì)算。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物及反應(yīng)條件Tab.2 Experiments primer and reaction condition

TBEVr，TBEVf：森林腦炎病毒Tick borne encephalitis virus；CF1，CR2：伯氏疏螺旋體Borreliaburgdoferi；套式引物OUT-1 OUT-2， IN-1 IN-2: 嗜吞噬細(xì)胞無形體Anaplasmaphagocytophilum；PIRO-A, PIRO-B:巴貝西蟲Babesia；Rsfg877, Rsfg1258:立克次體屬Rickettsia；HME-1F, HME-3R: 查菲埃立克體Ehrlichiaechaffeensis；FtC1, FtC4: 土拉菌F．tularensis.

1.2.3RT-PCR檢測：以提取的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照Promega反轉(zhuǎn)錄體系，加入1 μL RNA、dNTPs 0.4 μmol/L、1.25 U的RNase抑制劑、0.5 μg的random primer、1.5 U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶，加入適量的水至20 μL進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件為室溫放置10 min，42℃保溫1 h，之后95℃10 min后結(jié)束反應(yīng)，反應(yīng)完畢后將反應(yīng)體系稀釋至100 μL。取稀釋后反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL進(jìn)行PCR，用于檢測森林腦炎病毒，每檢測組設(shè)一例陰性對照，反應(yīng)體系同PCR體系，以DEPC處理過的水代替DNA模板。按照表1列出的引物和擴(kuò)增條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系同上。

2 結(jié)果

2.1 蜱類采集結(jié)果

本次采集共獲得蜱類標(biāo)本731只，經(jīng)鑒定分屬3屬3種，其中森林革蜱D.silvarum686只占總體構(gòu)成93.84%、全溝硬蜱I.persulcatus9只占總體構(gòu)成1.23%、嗜群血蜱H.concinna36只占總體構(gòu)成4.92%，具體數(shù)據(jù)及分布情況見表2及表3。

表3 蜱的種類及病原體檢測情況Tab.3 Tick sampled and tick borne pathogen detected in Heihe area

2.2 蜱媒病原檢測情況

采用8對引物對采集到的731只蜱分成95組進(jìn)行PCR檢測，陽性率按最小概率即每組一只陽性計(jì)算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅在黑河市采集的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)立克次體感染71例，最小陽性率為9.58%，隨機(jī)抽取7個立克次體陽性樣品，PCR擴(kuò)增后目的條帶經(jīng)測序后與NCBI上的同源基因進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與斑點(diǎn)群熱群立克次體(Spotted fever group rickettsiae，SFGR)的勞氏立克次體Rickettsiaraoultii病原體相似率最高，初步認(rèn)定為斑點(diǎn)熱群立克次體(GenBank登錄號: KC566999)。 Mediannikov等(2008)在與黑河毗鄰的俄羅斯的哈巴羅夫斯克市的森林革蜱中檢測出這種立克次體的菌株。森林腦炎病毒、伯氏螺旋體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、查菲埃立克體、巴貝西蟲及土拉菌病的檢測結(jié)果均為陰性，具體的采集地點(diǎn)及生境描述見表1，采集蜱類及病原體檢測情況見表3。

圖1 立克次體(屬)陽性樣品PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR detection for R. raoultii in D. silvarumM: DL2000marker; 1：陰性對照；2～7: 立克次體陽性樣品. M: DL2000marker; 1：Negative control；2-7: Positive samples.

3 討論

GPS及生境分析如表2所示，本文中大多數(shù)蜱來自黑河市黑呼公路7公路處，捕獲的蜱類主要以森林革蜱為主，森林革蜱與嗜群血蜱的比例約為24∶1，生境主要以小灌木林草地為主的牧區(qū)；遜克縣及孫吳縣捕獲的蜱種較單一分別是森林革蜱和嗜群血蜱，未發(fā)現(xiàn)其他蜱種；漠河縣捕獲的蜱數(shù)量較少但是全溝硬蜱的比例較高，全溝硬蜱與森林革蜱的比率幾乎為1∶1。首先從數(shù)量上看，牧區(qū)及有田間作業(yè)的區(qū)域蜱類的數(shù)量較為繁盛，這與蜱類的生活習(xí)性息息相關(guān)；再次從蜱種構(gòu)成上分析，緯度高的地區(qū)全溝硬蜱的數(shù)量更具優(yōu)勢，造成這種蜱種差異的原因較多，有可能與緯度及氣候有關(guān)，也可能與當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境質(zhì)量相關(guān)；從立克次體的感染率上看，只有黑河市存在著立克次體感染的情況，其他地區(qū)均未檢出，但不排除其他地區(qū)存在著蜱傳疾病病原體感染的情況，病原體的檢出率與檢測樣本數(shù)量的大小有密切關(guān)系，由于除黑河市以外其他地區(qū)采集到蜱類數(shù)量較少，可能影響了整體檢出率。

立克次體是一類嚴(yán)格的活細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞微生物，在自然界的許多脊椎動物中廣泛分布，蜱類是其重要的傳播媒介。在我國，從北向南，從東到西，以及中原地帶，都存在斑點(diǎn)熱群立克次體的感染。黑龍江是斑點(diǎn)熱群立克次體的主要疫區(qū)(劉國平等，2008)，孫秀峰等(2007)曾對黑龍江中俄口岸的立克次體情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大部分感染樣品屬北亞蜱傳傷寒立克次體R.sibirica感染，只有少數(shù)為R.heilongjiangensis和R.hulinii感染。Rickettsiaraoultii曾在歐洲的邊緣革蜱D.marginatus中發(fā)現(xiàn)，本文發(fā)現(xiàn)R.raoultii在森林革蜱中的存在，這和我國西藏地區(qū)報(bào)道的西藏革蜱D.everestianus和銀盾革蜱D.niveus(現(xiàn)更名為塔吉克斯坦革蜱D.daghestanicus)中發(fā)現(xiàn)的R.raoultii具有一定的相似性(Wangetal., 2012)，但由于自然地理?xiàng)l件和海拔的差異，R.raoultii的致病性和傳播特征是否存在差異有待進(jìn)一步研究。

本研究對中國與俄羅斯邊境黑河口岸地區(qū)2012年采集到的731只蜱攜帶的病原體進(jìn)行檢測。從蜱種構(gòu)成來看，森林革蜱是黑河地區(qū)的優(yōu)勢蜱種占總體構(gòu)成的93.8%，其次是嗜群血蜱，再次是全溝硬蜱。楊麗煒等(2009)曾經(jīng)對黑龍江口岸蜱類攜帶病原體進(jìn)行了調(diào)查，其中黑河口岸蜱類埃立克體感染率為4.48%，萊姆病的感染率為2.25%及斑點(diǎn)熱立克次體感染率為0.90%；國內(nèi)學(xué)者曾從中俄口岸地區(qū)的全溝硬蜱中分離出了巴貝西蟲病原體證明了我國中俄邊境地區(qū)蜱中存在微小巴貝西原蟲的自然感染源(Sunetal.，2008；付維明，2010)。在本調(diào)查中并未發(fā)現(xiàn)有萊姆病、巴貝西蟲及埃立克體病原體，這種調(diào)查結(jié)果的差異可能與地區(qū)蜱種構(gòu)成密切相關(guān)，付維明等(2009)在對中俄口岸各蜱種調(diào)查發(fā)現(xiàn)全溝硬蜱的帶菌率均較高，達(dá)到21.7%，森林革蜱和嗜群血蜱的帶菌率較低，平均為2.4%和3.3%。本實(shí)驗(yàn)中全溝硬蜱只占1.23%，攜帶病原體較低的蜱種森林革蜱數(shù)量占93.84%。何浩等(2008)對黑河地區(qū)蜱傳疾病調(diào)查時(shí)并沒有發(fā)現(xiàn)萊姆病螺旋體、巴貝西蟲及埃立克體陽性樣本，與本研究結(jié)果一致，除萊姆病、埃立克體、立克次體及巴貝西蟲外，黑河口岸還未有發(fā)現(xiàn)其他蜱媒病原體的報(bào)道。