伍 桐 馬雅軍

(1. 第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部病原生物學(xué)教研室，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)研究生管理大隊(duì)，上海 200433)

許多傳病按蚊屬于種團(tuán)或復(fù)合體的成員，中國(guó)的赫坎按蚊種團(tuán)(Anopheleshyrcanusgroup)、微小按蚊種團(tuán)(An.minimusgroup)和大劣按蚊復(fù)合體(An.diruscomplex)即是典型的例子，其成員種僅依據(jù)成蚊形態(tài)特征較難準(zhǔn)確區(qū)分(陸寶麟等，1997)。對(duì)于按蚊種團(tuán)或復(fù)合體隱種的鑒別研究始于上世紀(jì)20年代，從比較蟲(chóng)卵特征、吸血習(xí)性和交配的不相容性開(kāi)始，到觀察染色體核型等，發(fā)現(xiàn)了一些生態(tài)的、行為的、生化的和分子生物學(xué)的特征均為按蚊隱種鑒別提供了有益的證據(jù)。

業(yè)已證明，在用于蚊種鑒別的分子標(biāo)志中，核糖體DNA第2內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Ribosomal DNA second internal transcribed spacer，rDNA-ITS2)序列特征是較為理想的標(biāo)志(Collinsetal., 1996)，但也發(fā)現(xiàn)在近期分化的隱種間，其差異非常小，如岡比亞按蚊An.gambiae復(fù)合體的ITS2差異范圍為0.4%～1.6%(Paskewitzetal., 1994)，較難應(yīng)用。迄今，愈來(lái)愈多的蚊種ITS2序列被注冊(cè)到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，筆者在整理和分析中國(guó)按蚊屬蚊種已注冊(cè)ITS2序列的基礎(chǔ)上，對(duì)其在鑒別中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)述。因數(shù)據(jù)量較大，筆者將分為按蚊亞屬和塞蚊亞屬2個(gè)部分進(jìn)行報(bào)告。

1 材料與方法

1.1 rDNA-ITS2序列信息

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，以中國(guó)按蚊亞屬蚊種名為關(guān)鍵詞，搜索獲得所有登記的ITS2序列，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和整理。

1.2 序列分析方法

將下載的所有序列，首先采用Clustal X軟件包進(jìn)行對(duì)齊和比對(duì)分析，之后轉(zhuǎn)化為MEGA 5可識(shí)別文件，計(jì)算序列在種內(nèi)與種間的差異性(p-distance)。

2 結(jié)果

2.1 ITS2序列信息

截止2012年10月，GenBank中注冊(cè)的中國(guó)按蚊亞屬蚊種的ITS2序列共584條，隸屬20種(包括同物異名)、待定種5種和雜交種1個(gè)(表1)。

表1 中國(guó)按蚊亞屬蚊種在GenBank中的rDNA-ITS2序列信息(截止2012年10月)Tab.1 Nucleotide sequences of the rDNA-ITS2 of Chinese Subgenus Anopheles mosquitoes in the GenBank (by Oct. 2012)

續(xù)表1Tab.1continued

種類Species序列樣本信息Sequence featureGenBank登記號(hào)Accession number文獻(xiàn)References韓國(guó)Korea KLEK01GU384713-GU384716Joshi et al., 2010韓國(guó)KoreaDQ177501直接提交Direct submission韓國(guó)KoreaAY753740Li et al. 2005朝鮮按蚊An. koreicus中國(guó)ChinaAY523635Ma and Xu, 2005韓國(guó)KoreaDQ177500直接提交Direct submission貴陽(yáng)按蚊An. kweiyangensis中國(guó)ChinaAF261150Ma and Xu, 2005昆明按蚊An. kunmingensis中國(guó)China KM1/AKM3AY170920Ma and Xu, 2005雷氏按蚊An. lesteri韓國(guó)KoreaEU789791Park et al., 2008a韓國(guó)KoreaGU384717-GU384722Joshi et al., 2010韓國(guó)KoreaAY375468-AY375469Wilkerson et al., 2003韓國(guó)KoreaDQ177502直接提交Direct submission中國(guó)ChinaAF384172Ma and Xu, 2005中國(guó)ChinaAY803792-AY803801Ma and Xu, 2005中國(guó)ChinaAJ004941.2馬雅軍等, 1998; 馬雅軍等, 2002; Ma and Xu, 2005韓國(guó)KoreaAJ620899-AJ620902Hwang, 2007日本JapanAB159606直接提交Direct submission涼山按蚊An. liangshanensis中國(guó)China KM2/AKM4AY170922Ma and Xu, 2005中國(guó)ChinaAF146750Ma and Xu, 2005林氏按蚊An. lindesayi 韓國(guó)Korea sub_species ja-ponicusAJ620898直接提交Direct submission韓國(guó)Korea sub_species ja-ponicusDQ398773Sames et al., 2008中國(guó)ChinaJX944708直接提交Direct submission米賽按蚊An. messeae俄羅斯Russia M-35species BHE659702直接提交Direct submission俄羅斯Russia M-50species AHE659703直接提交Direct submission俄羅斯Russia N-6species BHE659704直接提交Direct submission俄羅斯Russia Ch-1species AHE659705直接提交Direct submission俄羅斯Russia Ch-2species BHE659706直接提交Direct submission俄羅斯Russia A-1 species AHE659707直接提交Direct submission俄羅斯Russia A-22species BHE659708直接提交Direct submission英國(guó)Russia 3594NHMEF090193直接提交Direct submission瑞典SwedenEF090194-EF090196直接提交Direct submission羅馬尼亞Romania RO18-86NHMEF090197直接提交Direct submission羅馬尼亞RomaniaAY648982-AY648998直接提交Direct submission英國(guó)EnglandAY238412Di Luca et al., 2004荷蘭HolandAY238413Di Luca et al., 2004意大利ItalyAY238414-AY238419.2Di Luca et al., 2004黑山MontenegroAY238420.3Di Luca et al., 2004南斯拉夫YugoslaviaAY238421.4Di Luca et al., 2004哈薩克斯坦KazakhstanAY238422Di Luca et al., 2004俄羅斯RussiaFN646200-FN646219直接提交Direct submission德國(guó)、意大利、奧地利Germa-ny, Italy, AustriaAY365011Proft et al., 1999英國(guó)EnglandAF452699-AF452700直接提交Direct submission英國(guó)EnglandAF504197-AF504236直接提交Direct submission希臘GreeceAF342711-AF342712Linton et al., 2001伊朗IranAY050639直接提交Direct submission俄羅斯Russia 4kAM409762-AM409776直接提交Direct submission俄羅斯Russia 8xyAM409782-AM409799直接提交Direct submission哈薩克斯坦Kazakhstan DbAa20AJ783400直接提交Direct submission意大利Italy mesRI-AZ50105Marinucci et al., 1999中國(guó)ChinaAF305556馬雅軍等, 2001帶足按蚊An. peditaeniatus泰國(guó)ThailandAB539056-AB539063Choochote, 2011泰國(guó)ThailandHM488269-HM488271Paredes-Esquivel et al., 2011中國(guó)ChinaAY129958Ma and Xu, 2005

續(xù)表1Tab.1continued

種類Species序列樣本信息Sequence featureGenBank登記號(hào)Accession number文獻(xiàn)References中國(guó)ChinaAF543862Gao et al., 2004暗灰按蚊An. pullus韓國(guó)KoreaEU789792Park et al., 2008a中國(guó)ChinaJN865246-JN865249周曉俊等, 2011韓國(guó)Korea Form AAY444345Park et al., 2003韓國(guó)Korea Form BAY444346Park et al., 2003韓國(guó)KoreaGU384701-GU384706Joshi et al., 2010韓國(guó)KoreaAY170923-AY170924Ma and Xu, 2005韓國(guó)KoreaAF146749Ma and Xu, 2005韓國(guó)KoreaAY375470-AY375471Wilkerson et al., 2003韓國(guó)KoreaDQ177503直接提交Direct submission薩氏按蚊An. sacharovi伊朗IranAY114204-AY114211Sedaghat et al., 2003a, 2003b土耳其TurkeyAY238395Di Luca et al., 2004亞美尼亞ArmeniaAY238396-AY238399Di Luca et al., 2004阿塞拜疆AzerbaijanAY238400-AY238404Di Luca et al., 2004伊朗IranAY238405Di Luca et al., 2004希臘GreeceAF466745-AF466748直接提交Direct submission希臘GreeceAF485805-AF485810直接提交Direct submission希臘GreeceAF462077-AF462143直接提交Direct submission阿塞拜疆Azerbaijan 10-6FN665793直接提交Direct submission阿塞拜疆Azerbaijan 2-1FN665795直接提交Direct submission伊朗Iran NHM11434FJ210878Azari-Hamidian et al., 2009伊朗IranFJ210888-FJ210891Azari-Hamidian et al., 2009伊拉克IraqEU346646-EU346655直接提交Direct submission伊朗Iran Tg23DQ662410直接提交Direct submission伊朗IranDQ243825-DQ243828Djadid et al., 2007伊朗IranDQ243832-DQ243833Djadid et al., 2007伊朗Iran D13TAFAY842515Djadid et al., 2007伊朗Iran D9TAFAY842517Djadid et al., 2007希臘Greece 2586NHMAF469854直接提交Direct submission阿塞拜疆AzerbaijanAY100456直接提交Direct submission-AY365012Proft et al., 1999伊朗Iran AZ3103AF436062直接提交Direct submission土耳其TurkeyFN565570-FN565575直接提交Direct submission俄羅斯RussiaAM269899直接提交Direct submission伊朗Iran S120AY533852直接提交Direct submission意大利Italy sactu-A1Z83198.2Marinucci et al., 1999中華按蚊An. sinensis日本Japan Form AEU931611-EU931612Park et al., 2008a日本Japan Form BEU931613-EU931614Park et al., 2008a日本JapanAB159603直接提交Direct submission韓國(guó)KoreaEU789790Park et al., 2008b泰國(guó)ThailandHM488258-HM488259Paredes-Esquivel et al., 2011韓國(guó)KoreaGU384691-GU384696Joshi et al., 2010日本Japan SINJ01GU384697Joshi et al., 2010泰國(guó)Thailand SINT01GU384698-GU384699Joshi et al., 2010中國(guó)China SINC01GU384700Joshi et al., 2010韓國(guó)Korea Form BAY130469-AY130471Min et al., 2002泰國(guó)Thailand Form AAY130472-AY130473Min et al., 2002韓國(guó)KoreaWCKR_2AY130474Min et al., 2002韓國(guó)KoreaDQ177504直接提交Direct submission韓國(guó)Korea 1AY375464Wilkerson et al., 2003韓國(guó)Korea 1AY339278Hwang et al., 2006中國(guó)ChinaAF543861Gao et al., 2004中國(guó)China SMMU-SZGQ161923馬穎等, 2009中國(guó)China 2AY375465Wilkerson et al., 2003

續(xù)表1Tab.1continued

種類Species序列樣本信息Sequence featureGenBank登記號(hào)Accession number文獻(xiàn)References中國(guó)ChinaAY316154-AY316155Ma and Xu, 2005中國(guó)ChinaAY316156Ma and Xu, 2005中國(guó)ChinaAJ004942馬雅軍等, 1998; 馬雅軍等, 2002; Ma and Xu, 2005擬中華按蚊An. sineroides韓國(guó)KoreaEU789795Park et al., 2008a韓國(guó)KoreaGU384723-GU384725Joshi et al., 2010韓國(guó)KoreaDQ177505直接提交Direct submission韓國(guó)KoreaAJ620895直接提交Direct submission日本JapanAB159605直接提交Direct submission八代按蚊An. yatsushiroensis中國(guó)ChinaAY186791-AY186792Ma and Xu, 2005中國(guó)China YASCAY170925Ma and Xu, 20052An. sp.YM-2003a中國(guó)ChinaAY306128Ma and Xu, 2005#2An. hyrcanus group 泰國(guó)Thailand TR6HM488268Paredes-Esquivel et al., 2011An. sp.3.CPE-2010泰國(guó)Thailand TR3HM488272-HM488267Paredes-Esquivel et al., 20112An. hyrcanus group An. sp.LL1中國(guó)ChinaJX944687-JX944703直接提交Direct submission2An. hyrcanus group An. sp.LL2中國(guó)ChinaJX944704直接提交Direct submission2An. hyrcanus group An. sp.LL3中國(guó)ChinaJX944705-JX944707直接提交Direct submission3An. kleini×An. sinensis 韓國(guó)KoreaGQ265915-GQ265916Joshi et al., 2009

注：1同物異名An.lesteri, synonym ofAn.lesteri;2尚未訂名的種類, unnamed species;3雜交種, hybride; - 無(wú)測(cè)序樣本信息, no information of sequenced sample;§原文中為待定種An. sp. 2；The original paper as the unnamed speciesAn. sp. 2;#原文中為待定種An. sp. 1, The original paper as the unnamed speciesAn. sp. 1.

2.2 ITS2序列在種內(nèi)的差異

2.2.1中華按蚊: 已注冊(cè)ITS2序列的中華按蚊樣本來(lái)源于中國(guó)、日本、韓國(guó)和泰國(guó)，樣本信息描述包括中華按蚊A型和B型(Form)，此型是據(jù)染色體核型不同而確定(Baimaietal., 1993)，有學(xué)者純化培養(yǎng)了來(lái)自泰國(guó)和日本的中華按蚊兩型，以及韓國(guó)的B型，分別在實(shí)驗(yàn)室雜交，結(jié)果顯示雜交的子代可育(Parketal., 2008b)。筆者比對(duì)了所有注冊(cè)的中華按蚊ITS2序列，結(jié)果顯示其間差異小于1%，泰國(guó)的中華按蚊A型(AY130472-AY130473)與其他序列間存在3處固定變異，而日本的中華按蚊A型(EU931611-EU931612)卻未見(jiàn)上述改變，提示中華按蚊的兩型目前在ITS2序列水平尚無(wú)法區(qū)分。

2.2.2八代按蚊與暗灰按蚊: 八代按蚊與暗灰按蚊的序列均由韓國(guó)和中國(guó)的學(xué)者注冊(cè)，有學(xué)者認(rèn)為在韓國(guó)分布的八代按蚊是暗灰按蚊同物異名(Shinetal.，2001)，但因未與模式產(chǎn)地(日本Yatsushiro Kyushu)和中國(guó)的標(biāo)本進(jìn)行比較，故筆者將采自中國(guó)的樣本仍沿用八代按蚊的學(xué)名。

在已注冊(cè)ITS2序列的暗灰按蚊中，部分樣本信息描述為A型和B型，其差異僅表現(xiàn)在形態(tài)特征、生態(tài)習(xí)性和染色體核型，實(shí)驗(yàn)室雜交能產(chǎn)生可育后代(Parketal., 2003)。將所有暗灰按蚊與八代按蚊的ITS2序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)除2條序列存在雙堿基突變外(JN865249和GU384702)，其他序列間的差異均顯現(xiàn)在2處兼并堿基位點(diǎn)，差異性小于0.5%。

2.2.3雷氏按蚊與嗜人按蚊: 雷氏按蚊與嗜人按蚊的分類地位經(jīng)多次反復(fù)修訂，現(xiàn)已公認(rèn)嗜人按蚊是雷氏按蚊的同物異名(瞿逢伊，2008)，但在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中仍存在未更新的嗜人按蚊ITS2序列(AJ620897)。已注冊(cè)ITS2序列的雷氏按蚊樣本來(lái)自韓國(guó)、中國(guó)和日本，比對(duì)后發(fā)現(xiàn)來(lái)自韓國(guó)樣本的4條序列(AJ620899-AJ620902)與其他序列間的差異大于8%(Hwang，2007)，故比對(duì)時(shí)需謹(jǐn)慎，剩余的序列間差異小于0.9%。

筆者早前文章中報(bào)告的“雷氏按蚊”(馬雅軍等，2000；Maetal., 2000; 馬雅軍等，2002)，在后續(xù)的研究中，發(fā)現(xiàn)鑒定有誤，即以“待定種”代表(Maetal., 2005; 瞿逢伊，2005)，后經(jīng)進(jìn)一步研究比對(duì)，目前證實(shí)應(yīng)為比倫按蚊(馬穎等，2009；Rueda, 2005)。

2.2.4須喙按蚊: 須喙按蚊的序列目前已注冊(cè)112條，樣本來(lái)自印度尼西亞和泰國(guó)。來(lái)自印度尼西亞的須喙按蚊樣本描述分為5支(clade)，其中第Ⅳ與Ⅴ支，Ⅱ與Ⅲ支間的樣本序列幾乎無(wú)差異，而兩者間的差異性約為18%，第Ⅰ支與其的差異性約為23%和18%(Paredes-Esquiveletal., 2009)；來(lái)自泰國(guó)的樣本描述分為4個(gè)型(Form A/B/C/D)，依據(jù)染色體核型確定，而ITS2序列間的差異性可達(dá)40%，其間差異程度與染色體核型未發(fā)現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系(Saeungetal., 2007, 2008；Suwannamitetal., 2009)。迄今，來(lái)自中國(guó)的須喙按蚊樣本ITS2序列尚未注冊(cè)，故應(yīng)謹(jǐn)慎使用GenBank中的須喙按蚊ITS2序列。

2.2.5米賽按蚊: 米賽按蚊的序列目前已經(jīng)注冊(cè)有143條，樣本分別來(lái)自俄羅斯、英國(guó)、瑞典和中國(guó)等14個(gè)國(guó)家，比對(duì)所有的序列，其間差異性小于1%，差異最大的樣本均來(lái)自俄羅斯(AM409762-AM409776，AM409782-AM409799)和伊朗(AY050639)，注冊(cè)者為Bezzhonova和Djadid等。

2.2.6其他蚊種: 薩氏按蚊已注冊(cè)序列132條，樣本來(lái)自8個(gè)國(guó)家，其間差異性小于1%，中國(guó)的樣本尚無(wú)序列注冊(cè)。赫坎按蚊已注冊(cè)序列44條，樣本來(lái)自4個(gè)國(guó)家，其中1條序列(EF613293)與其他的序列差異性為1.3%(Djadidetal., 2009)，其余的序列間差異均小于1.0%。

另外，在整理已注冊(cè)按蚊亞屬蚊種的ITS2序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)在中國(guó)分布的有4個(gè)序列類型未訂其學(xué)名，比對(duì)其序列，顯示與各類型相似度最高蚊種分別如下：YM-2003a與雷氏按蚊(84%)、 LL1與涼山按蚊(80%)、LL2與An.hyrcanusgroupAn. sp.3.CPE-2010(100%)、LL3與比倫按蚊(93%)。另外，韓國(guó)學(xué)者還注冊(cè)了中華按蚊與克萊按蚊雜交種的ITS2序列2條，分別與中華按蚊、克萊按蚊的相似性為100%(Joshietal., 2009)，筆者的實(shí)驗(yàn)室也曾檢測(cè)到我國(guó)遼寧省野外存在的中華按蚊與克萊按蚊雜交種樣本。

除上述和僅注冊(cè)1條序列的蚊種外，其余的已注冊(cè)的ITS2序列的按蚊亞屬種內(nèi)差異性均小于0.5%。

2.3 ITS2序列在種間的差異

筆者選取在GenBank中注冊(cè)的中國(guó)按蚊亞屬種類的其中1條序列作為蚊種的代表，進(jìn)行種間序列差異分析，結(jié)果顯示差異范圍為1.2%～69.5%(表2)，其中種間差異性小于3%的僅為昆明按蚊與涼山按蚊、八代按蚊與筠連按蚊,其余種間的差異性均大于5%。

表2基于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的中國(guó)按蚊亞屬部分種類種間rDNA-ITS2序列差異性

Tab.2 Interspecific variation of the rDNA-ITS2 of Chinese Subgenus Anopheles mosquitoes,according to GenBank database

1:An.lesteri_AJ004941; 2:An. sp YM-2003a_AY306128; 3:An.belenrae_AY187728; 4:An. sp. LL3_JX944705; 5:An.kleini_FJ875072; 6:An.sinensis_AJ004942; 7:An.kunmingensis_AY170920; 8:An.liangshanensis_AY170922; 9:An.kweiyangensis_AF261150; 10:An.sineroides_GU384723; 11:An. sp. LL1_JX944687; 12:An.junlianensis_AY316155; 13:An.yatsushiroensis_AY186792; 14:An.hyrcanus_AF261149; 15.An.crawfordi_AF261949; 16:An.peditaeniatus_AY129958; 17:An. sp. LL2_JX944704; 18:An.messeae_AF305556; 19:An.sacharovi_AY238405; 20:An.lindesayi_JX944708; 21:An.koreicus_AY523635; 22:An.barbirostris_AB435969.

3 討論

核糖體DNA是一個(gè)多拷貝基因家族，在細(xì)胞的多個(gè)轉(zhuǎn)錄單元中為一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)陣列，陣列可位于相同或不同染色體上，每個(gè)rDNA的轉(zhuǎn)錄單元在蚊蟲(chóng)中由3個(gè)基因、1個(gè)外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和2個(gè)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)組成，外部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)互相連接rDNA。rDNA是遺傳信息的寶貴來(lái)源，功能區(qū)產(chǎn)生的核糖體高度保守，轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列又具有較高的種間和種內(nèi)變異。諸多的研究，以及本文的分析顯示rDNA-ITS2序列的差異性在按蚊中具有良好的種內(nèi)保守性和種間解析度(Dixitetal., 2010)，但因序列間長(zhǎng)度差異大，比對(duì)困難，故不適合更高階元的系統(tǒng)發(fā)育分析。

筆者在整理GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已注冊(cè)的中國(guó)按蚊亞屬蚊種的ITS2序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)仍有近1/3的、分布局限和無(wú)醫(yī)學(xué)重要性的種尚無(wú)序列注冊(cè)；在已注冊(cè)的序列中，由采自中國(guó)的樣本測(cè)定的序列數(shù)量也較少。提示中國(guó)學(xué)者應(yīng)加強(qiáng)研究，將測(cè)定的序列及時(shí)提交，一方面可供科學(xué)家們共享信息，另一方面可更準(zhǔn)確和客觀地評(píng)價(jià)ITS2分子標(biāo)志的價(jià)值。

通過(guò)分析已注冊(cè)的ITS2序列，提示其在中國(guó)按蚊亞屬蚊種間具有良好的解析度，但也發(fā)現(xiàn)在部分種內(nèi)存在一定程度的變異性(通常小于1%)。種內(nèi)差異性存在的原因應(yīng)是該種的進(jìn)化快速且活躍，近期或正在隱種分化，如：中華按蚊種內(nèi)差異性小于1%，已發(fā)現(xiàn)的野外中華按蚊與克萊按蚊的雜交種的事實(shí)，即是克萊按蚊從中華按蚊正在分化的印證和足跡。

筆者整理和分析GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)因注冊(cè)者不同導(dǎo)致的種內(nèi)序列差異屢見(jiàn)不鮮，有時(shí)難以判斷其可靠性，故筆者以為出現(xiàn)上述情形時(shí)，應(yīng)綜合其他信息判斷，如樣本來(lái)源、鑒定者、注冊(cè)者和序列是否發(fā)表等。