張月梅 顏春魯 劉永琦 蘇 韞 范 萍 吳曉晶 董介正

視網(wǎng)膜缺血是視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層凋亡的主要原因之一，是嚴(yán)重威脅視力的臨床常見眼底疾病，至今仍無有效的治療方法來阻止或逆轉(zhuǎn)這類疾病的退行性改變。尋找非視網(wǎng)膜來源的、可替代視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞功能的細(xì)胞作為理想移植供體是目前需要攻克的難題。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有向心肌細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞樣細(xì)胞等分化能力〔1〕，已成為骨科、心血管科、神經(jīng)科、眼科等治療的主要種子細(xì)胞之一〔2-4〕。中醫(yī)藥素有滋陰補陽、強身壯體、增智健腦、抗衰老和調(diào)節(jié)免疫功能之功效。本課題用不同補腎法（補益腎陰法、陰陽雙補法、補益腎陽法）代表方藥左歸丸、地黃飲子、右歸丸含藥血清孵育BMSCs，觀察不同補腎方藥對BMSCs的誘導(dǎo)分化作用，從而篩選出可高效誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的補腎法及代表方藥。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

提取BMSCs的動物：SPF級Wistar大鼠15只，雌雄不限，體重（120±10）g。制備含藥血清的動物：SPF 級 Wistar大鼠 40 只，雌雄不限，體重（250±20）g。以上動物皆由甘肅中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證號：SCXK（甘）2004-0006。

1.2 實驗藥物

左歸丸、右歸丸、地黃飲子均購自甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，經(jīng)中藥教研室鑒定，均為正品。

1.3 主要藥品試劑與儀器

L-DMEM 培養(yǎng)基（GⅠB-CO Ⅰnvitrogen Corporation，批號1240031），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號 090123），0.25%胰酶（Sigma），L-谷氨酰胺（上海新興醫(yī)藥保健品科技開發(fā)中心，批號 991085），全反式維甲酸（Sigma），CD45 熒光標(biāo)記抗體（Gibco公司），CD90熒光標(biāo)記抗體（Gibco公司），Nestin、NSE、GFAP 免疫組化試劑盒；二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO Electric Co.Ltd，型號 MOA-18ALC），超凈工作臺（蘇州凈化儀器廠，型號SW-CJ-2FD），流式細(xì)胞儀（美國貝克曼公司）。

1.4 BMSCs的分離培養(yǎng)、鑒定

采用全骨髓貼壁篩選法分離培養(yǎng)、純化BMSCs，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面標(biāo)志CD90及造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD45的表達(dá)率。

1.5 中藥含藥血清的制備

40只Wistar大鼠，隨機分為4組：空白組、左歸丸全藥組（補益腎陰法代表方藥）、地黃飲子全藥組（陰陽雙補法代表方藥）和右歸丸全藥組（補益腎陽法代表方藥）。晚禁食，第2天，空白組給生理鹽水，其余組給藥液（劑量按1 g生藥/100 g大鼠），連續(xù)3 d，2次/d；于第3天給藥后2 h從股動脈取血，分離血清 （3 000 r/min，10 min），56 ℃滅活 30 min，0.22 μm濾器過濾除菌，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 對F3代BMSCs進(jìn)行補腎方藥含藥血清孵育

將已純化的BMSCs（F3代）接種至培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞70%～80%融合后，棄完全培養(yǎng)液，隨機分組，分別用含10%左歸丸、右歸丸、地黃飲子中藥血清和維甲酸的L-DMEM培養(yǎng)液孵育，連續(xù)培養(yǎng)3 d。將誘導(dǎo)的BMSCs用0.25%的胰酶消化，待細(xì)胞變形、間隙增大，加入含10%胎牛血清的DMEM中止消化，磷酸鹽緩沖液輕洗，吹打成1×106個/ml細(xì)胞懸液，備用。

1.7 誘導(dǎo)后細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)志蛋白檢測

誘導(dǎo)后細(xì)胞隨機分為8組，分別為空白誘導(dǎo)組、左歸丸誘導(dǎo)組、地黃飲子誘導(dǎo)組、右歸丸誘導(dǎo)組、維甲酸（retinoic acid,RA）誘導(dǎo)組、左歸丸聯(lián)合RA誘導(dǎo)組、右歸丸聯(lián)合RA誘導(dǎo)組、地黃飲子聯(lián)合RA誘導(dǎo)組。按時間段分為2個階段，第1階段于誘導(dǎo)后5 h，第2階段于誘導(dǎo)后72 h，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)[巢蛋白（Nestin）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）檢測。光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。以Nestin抗原表達(dá)鑒定神經(jīng)干細(xì)胞，NSE抗原表達(dá)鑒定分化形成的神經(jīng)元，GFAP抗原表達(dá)鑒定分化形成的膠質(zhì)細(xì)胞，此三者均為胞漿表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測采用SABC改良法進(jìn)行。

免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：細(xì)胞漿中呈棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。顯微鏡下計數(shù)，隨機選取3張片子，每張片子隨機選取5個非重疊視野（100倍），陽性細(xì)胞率（%）=陽性細(xì)胞數(shù)÷（陽性細(xì)胞數(shù)＋陰性細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，SNK-q檢驗進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs的形態(tài)及CD90、CD45的表達(dá)

F3代細(xì)胞形態(tài)單一均勻，融合后呈典型的極性，漩渦狀生長（圖1）。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面標(biāo)志CD90及造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD45的表達(dá)，CD90＋、CD45-細(xì)胞為 97.0%（圖 2）。

2.2 誘導(dǎo)后細(xì)胞神經(jīng)標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平

誘導(dǎo)后除空白組及右歸丸組外，其余各組BMSCs胞體不同程度收縮，突起伸出；免疫組化顯示，各藥物誘導(dǎo)組的細(xì)胞Nestin、NSE、GFAP均有不同程度的陽性表達(dá)。

2.2.1 誘導(dǎo)后細(xì)胞Nestin的表達(dá)水平：誘導(dǎo)5 h、72 h時，與空白組、右歸丸組比較，其余各藥物誘導(dǎo)組Nestin均明顯升高（P＜0.01），其中以地黃飲子聯(lián)合維甲酸組、左歸丸聯(lián)合維甲酸組的Nestin表達(dá)為最高（P＜0.01）。藥物誘導(dǎo)72 h時，地黃飲子單獨及聯(lián)合維甲酸誘導(dǎo)組、左歸丸組的Nestin表達(dá)高于本組藥物誘導(dǎo) 5 h 時的結(jié)果（P＜0.05）（表1）。

表1 不同藥物誘導(dǎo)大鼠BMSCs不同時間后Nestin 的表達(dá)水平（±s，%）

表1 不同藥物誘導(dǎo)大鼠BMSCs不同時間后Nestin 的表達(dá)水平（±s，%）

注：同一列不同字母者間比較，P＜0.01（SNK-q檢驗）；5 h與72 h組內(nèi)比較，①P＜0.05（單因素方差分析） BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

2.2.2 誘導(dǎo)后細(xì)胞NSE的表達(dá)水平：與空白組、右歸丸組比較，誘導(dǎo)5 h時，3種中藥血清聯(lián)合維甲酸組及單純維甲酸誘導(dǎo)組NSE表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）；誘導(dǎo)72 h時，除上述4組外，左歸丸組、地黃飲子組的NSE表達(dá)也明顯高于空白組和右歸丸組（P＜0.01），其中左歸丸組的均值變化較為明顯，與5 h時結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義的差異（P＜0.05）。2個時間點中均以左歸丸聯(lián)合維甲酸組、地黃飲子聯(lián)合維甲酸組的 NSE 表達(dá)為最高（P＜0.05）（表2）。

表2 不同藥物誘導(dǎo)BMSCs不同時間后NSE的表達(dá)水平（±s，%）

表2 不同藥物誘導(dǎo)BMSCs不同時間后NSE的表達(dá)水平（±s，%）

注：同一列不同字母，且同時帶有“+”或同時帶有“*”者間比較，P＜0.05；同一列不同字母，不同時帶有“+”或“*”者間比較，P＜0.01（SNK-q檢驗）；5 h與 72 h組內(nèi)比較，①P＜0.05（單因素方差分析）BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

組別 樣本數(shù) 5 h 72 h左歸丸+維甲酸組 6 50.30±0.66c 53.20±3.30d地黃飲子+維甲酸組 6 53.60±5.01c* 57.37±1.10d*右歸丸+維甲酸組 6 43.77±3.38b* 47.30±1.91b*左歸丸組 6 23.53±8.40a 36.23±2.86bc①地黃飲子組 6 25.77±4.30a 32.63±3.04c+右歸丸組 6 20.43±5.64a 19.53±2.32a維甲酸組 6 42.70±2.26b 42.37±2.04b+空白組 6 18.27±4.49a 19.17±3.83a

2.2.3 誘導(dǎo)后細(xì)胞GFAP的表達(dá)水平：各時間點不同藥物誘導(dǎo)組間GFAP表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。

表3 不同藥物誘導(dǎo)BMSCs不同時間后GFAP的表達(dá)水平（±s，%）

表3 不同藥物誘導(dǎo)BMSCs不同時間后GFAP的表達(dá)水平（±s，%）

注：各組間比較，P＞0.05（SNK-q檢驗） BMSCs：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

組別 樣本數(shù) 5 h 72 h左歸丸+維甲酸組 6 10.07±2.04 11.27±2.11地黃飲子+維甲酸組 6 10.17±1.72 10.40±2.14右歸丸+維甲酸組 6 9.93±1.65 11.07±2.28左歸丸組 6 10.80±2.18 9.70±1.47地黃飲子組 6 8.97±1.54 11.10±2.16右歸丸組 6 10.43±1.80 10.17±1.63維甲酸組 6 9.47±1.39 9.17±1.68空白組 6 8.53±1.62 8.73±1.60

3 討論

《內(nèi)經(jīng)》 曰：“腎生骨髓”，“其充在骨”?！夺t(yī)經(jīng)精義》曰：“腎藏精，精生髓”，“髓者，腎精所在，精足則髓足”。即腎精充足，則骨髓生化有源。若腎精虛少，則骨髓化源不足。

劉柏炎等〔5〕認(rèn)為干細(xì)胞可歸于中醫(yī)正氣范疇，胚胎干細(xì)胞與先天之精氣有關(guān)。中醫(yī)學(xué)的“精”在內(nèi)涵上與干細(xì)胞有很大的相關(guān)性，干細(xì)胞具先天之精屬性，是先天之精在細(xì)胞層次的存在形式。根據(jù)干細(xì)胞具先天之精屬性理論及精生髓通腦理論，張進(jìn)等〔5〕認(rèn)為，來自骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）同屬先天之精，它們能相互轉(zhuǎn)化，補腎填精法可能會對這種MSC向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化起促進(jìn)作用。陳東風(fēng)等〔7〕報道大鼠MSC經(jīng)龜板含藥血清體外誘導(dǎo)后分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞神經(jīng)絲蛋白表達(dá)陽性，誘導(dǎo)12 h后，神經(jīng)元樣細(xì)胞陽性率達(dá)到高峰，細(xì)胞存活時間較長，至第7天仍有神經(jīng)元樣細(xì)胞存活。鄺學(xué)媚等〔8〕報道三甲復(fù)脈湯含藥血清體外誘導(dǎo)成年大鼠BMSCs分化也有類似發(fā)現(xiàn)。

基于以上“腎生髓”理論，在本實驗中我們選用了補腎方藥（補益腎陰方藥左歸丸，陰陽雙補方藥地黃飲子，補益腎陽方藥右歸丸）進(jìn)行研究，探討它們在體外促BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化中的作用。Nestin存在于神經(jīng)上皮干細(xì)胞中，為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物；NSE主要存在于神經(jīng)細(xì)胞中，為成熟神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志物；GFAP存在于正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞中，為構(gòu)成成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞中間絲的主要成分。

實驗研究結(jié)果表明，體外誘導(dǎo)5 h、72 h時，與空白組比較，各藥物誘導(dǎo)組Nestin、NSE均明顯升高，提示左歸丸、地黃飲子、右歸丸有誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化的可能性。不同補腎法能夠促BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化，且補陰類代表方左歸丸和陰陽雙補類代表方地黃飲子誘導(dǎo)分化的效果優(yōu)于補陽類代表方右歸丸，這也正符合了中醫(yī)“腎生髓，通于腦”理論實質(zhì)。中醫(yī)理論認(rèn)為，腎“主骨、生髓、通于腦”，三者皆來源于先天的腎之精氣；BMSCs來源于骨髓，而骨髓又屬陰髓，故補益腎陰、陰陽雙補法可促進(jìn)BMSCs的增殖。

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[5]劉柏炎，蔡光先.試論中醫(yī)學(xué)精氣與干細(xì)胞生物學(xué)的關(guān)系[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，23（6）：29.

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[7]陳東風(fēng)，杜少輝，李尹為，等.龜板含藥血清體外誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，20（3）：224-226.

[8]鄺學(xué)媚，廖欣，杜少輝，等.三甲復(fù)脈湯含藥血清體外誘導(dǎo)成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元[J].中國臨床康復(fù)，2005，9（30）：53-55.