沈靜茹，蔡 薇，余學(xué)紅，王 偉，張 祎

(1中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，分析化學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗室;2中南民族大學(xué)校醫(yī)院，武漢430074)

氧氟沙星是一種喹諾酮類廣譜抗菌藥，為DNA螺旋酶抑制劑，主要通過選擇性抑制細(xì)菌DNA回旋酶的活性，阻礙細(xì)菌DNA的合成，達(dá)到殺菌的目的.藥品氧氟沙星是其左旋和右旋異構(gòu)體的消旋體化合物，其中左旋光學(xué)異構(gòu)體的抗菌活性較右旋體強(qiáng)［1］.目前，在高效毛細(xì)管電泳(HPCE)中用 β-環(huán)糊精(CD)及其衍生物作為手性拆分氧氟沙星的主要方法是手性添加劑法.如Khaldun M.Al Azzam［2］采用硫酸基-β-CD手性添加劑法使氧氟沙星對映體得到基線分離，分離度Rs達(dá)5.45;馬騫［3］等分別采用β-CD，HP-β-CD(羥丙基-β-CD)和 DM-β-CD(二甲基-β-環(huán)糊精)對氧氟沙星對映體進(jìn)行了拆分，結(jié)果β-CD不能分離氧氟沙星，HP-β-CD分離效果較差且分析時間較長，DM-β-CD可使氧氟沙星達(dá)到基線分離.Li Yingjie［4］用 Asp-β-CD、NH2-β-CD、HP-β-CD以聚合物手性整體形式聚合到以甲基丙烯酸縮水甘油酯及乙烯二甲基丙烯酸酯為單體制備的整體柱上，成功實(shí)現(xiàn)了幾種外消旋體中對映異構(gòu)體的分離及幾種常見氨基酸的分離;Tian Yun［5］用新型的β-CD衍生物HPCE整體柱成功分離了布洛芬和萘普生;Koide Takashi［6］用手性冠醚鍵合的整體柱分離了主要的氨基化合物對映體.

本文首次采用新型β-CD衍生物手性HPCE整體柱，即選用雙-(6-氧-間羧基苯磺?；?β-CD(簡稱β-CD-M1)，將其作為固定相中單體制備HPCE整體柱，在高效毛細(xì)管電泳儀上分離手性藥物氧氟沙星對映體，分離度Rs可達(dá)7.72，與文獻(xiàn)［2］中硫酸基-β-CD衍生物比多了苯環(huán)的π-電子的影響和間位羧基的作用，構(gòu)建的手性環(huán)境與氧氟沙星對映異構(gòu)體之間的相互作用位點(diǎn)相對較豐富，故而達(dá)到更優(yōu)分離效果，為分離氧氟沙星對映異構(gòu)體提供了新的手性HPCE整體柱拆分方法.

1 實(shí)驗部分

1.1 主要儀器和試劑

高效毛細(xì)管電泳儀(CL1020型，北京彩陸科學(xué)儀器有限公司，中國科學(xué)院研究生院應(yīng)用化學(xué)所)，酸度計(pHS-3C型，上海偉業(yè)儀器儀表廠)，融硅石英毛細(xì)管(75 μm，有效長度55 cm，河北永年光纖廠)，0.22 μm微孔濾膜(上海市新亞凈化儀器廠).

三羥甲基氨基甲烷(Tris，上海山浦化工有限公司)，磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸(信陽市化學(xué)試劑廠)，氧氟沙星片(廣州白云山制藥有限公司)氧氟沙星對照品(含量98.8%，中國藥品生物制品檢定所)、超純水(美國 Moleculer超純水機(jī))，雙-(6-氧-間羧基苯磺酰基)-β-環(huán)糊精［7］自行合成，其他試劑均為分析純.

1.2 藥品前處理

將氧氟沙星片溶于水中，用超純水稀釋，配置成不同濃度，氧氟沙星對照品，用超純水配置成10－9g/L，Tris-H3PO4緩沖液按實(shí)驗需要配置成不同濃度和pH.所有溶液均經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾.

1.3 HPCE整體柱分析前處理

HPCE手性整體柱在每次運(yùn)行之前用Tris-H3PO4緩沖液沖洗1 h，采用注射器壓力進(jìn)樣20 s，分離電壓為25 kV，檢測波長為254 nm，溫度20℃.

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖液pH值對分離的影響

在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱上，檢測波長254 nm，工作電壓25 kV，10－8g/L氧氟沙星進(jìn)樣20 s，20℃的電泳條件下，固定 Tris-磷酸總濃度為50mmol/L，通過改變?nèi)芤褐辛姿岬牧縼砀淖內(nèi)芤旱膒H 值，使之分別為 3.5、3.7、4.0、4.5、5.0、5.5，分離結(jié)果見圖1.如圖1所示，氧氟沙星對映體的分離度均大于7，表明緩沖液pH在上述范圍內(nèi)變化對分離度的影響較小，在此酸度范圍內(nèi)整體柱內(nèi)pH對電滲流的影響變小，緩沖液pH為5.0時氧氟沙星對映體雖可分離(Rs=7.47)，但基線不穩(wěn);pH大于5.0時，氧氟沙星的洗脫強(qiáng)度減弱;緩沖液pH在3.5～5.0時，氧氟沙星對映體均達(dá)到基線分離;緩沖液pH 小于 3.5(pH 2.8～3.4)時，毛細(xì)管整體柱柔韌性變?nèi)?，易?pH為4.0時分離度最大且峰對稱性、洗脫強(qiáng)度、基線均較理想:故選擇緩沖液為pH 4.0.

圖1 不同pH對氧氟沙星對映體分離度的影響Fig.1 Effect of different pH buffer on the separation of ofloxacin

2.2 緩沖液濃度對分離的影響

在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱上，檢測波長254 nm，工作電壓25 kV，進(jìn)樣10－8g/L氧氟沙星20 s，Tris-磷酸緩沖液 pH 4.0，20℃ 的電泳條件下，改變緩沖液 Tris-磷酸的濃度分別為10，20，30，40，50，60，70，80 mmol/L，結(jié)果見表 1.如表1 所示，緩沖液濃度為10 mmol/L或80 mmol/L均未有物質(zhì)洗出，在20～70 mmol/L范圍內(nèi)，氧氟沙星兩對映體均可達(dá)到基線分離.緩沖液濃度較低，基線出現(xiàn)漂移，且有雜峰出現(xiàn);緩沖液濃度較高時，基線同樣出現(xiàn)漂移和雜峰，且緩沖液對氧氟沙星的洗脫強(qiáng)度較小;緩沖液濃度為50 mmol/L時，峰形較為對稱，基線平穩(wěn)，緩沖液對氧氟沙星的洗脫強(qiáng)度較大:故選擇緩沖液濃度為50 mmol/L為最適濃度.

表1 不同緩沖液濃度對氧氟沙星對映體分離的影響Tab.1 Effect of different buffer concentrations on the separation of ofloxacin enantioseparation

2.3 不同電壓對分離的影響

在β-CD-M1衍生物HPCE整體柱上，檢測波長254 nm，進(jìn)樣 10－8g/L 氧氟沙星 20 s，Tris-磷酸緩沖液 50 mmol/L，pH 4.0，20℃的電泳條件下，分別考察5，10，15，20，25，28 kV 時，氧氟沙星對映體的分離狀況，結(jié)果見圖2.如圖2所示，改變分離電壓對電遷移和電滲流有一定的影響，增加電壓有利于加快分離速度.隨著電壓的逐漸增大保留時間逐漸減小，當(dāng)電壓達(dá)到28 kV時兩峰重疊，無法分離;而電壓為25kV時峰形對稱，兩峰響應(yīng)相當(dāng)，且洗脫強(qiáng)度均較大，總的分離分析時間最短，達(dá)到基線分離:故選擇電壓為25 kV為最適電壓.

圖2 不同電壓下的氧氟沙星對映體分離圖Fig.2 Effect of voltages on the separation of ofloxacin enantioseparation

2.4 方法評價

2.4.1 對照品線性范圍

配置氧氟沙星對照品溶液，濃度分別為:2×10－9，3 ×10－9，4 ×10－9，5 ×10－9，6 ×10－9g/L，在β-CD-M1為單體制備的手性HPCE整體柱上，分離電壓 25 kV，Tris-H3PO450 mmol/L，pH 4.0，檢測波長254 nm，進(jìn)樣20 s的條件下，考察了氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍，氧氟沙星前峰峰高與濃度線性方程為 y=26598.78+4.817 × 10－13x，r=0.9804，前峰峰面積與濃度線性方程為y=202662.36+3.746×10－14x，r=0.9779;后峰峰高與濃度的線性方程為y=36914.14+4.652 ×10－13x，r=0.9614，后峰峰面積與濃度的線性方程為 y=139120+3.48092×10－14x，r=0.9872.

2.4.2 精密度測定

將濃度為2×10－9g/L的氧氟沙星對照品，在最佳分離條件下，重復(fù)進(jìn)樣7次測定兩組份的保留時間tR、峰高h(yuǎn)、峰面積A，結(jié)果見表2.由表2可知，前峰各電泳參數(shù)的RSD為5.37%～12.54%，而后峰的各參數(shù)RSD為4.22%～5.18%，說明后峰各參數(shù)重現(xiàn)性優(yōu)于前峰.

表2 氧氟沙星對照品精密度測定結(jié)果(n=7)Tab.2 Results of ofloxacin eniramine standard precision determination(n=7)

2.4.3 對比實(shí)驗

在50mmol/L Tris-H3PO4緩沖液，pH 值為4.0，進(jìn)樣量為10－9g/L，進(jìn)樣時間20s的氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，20℃的電泳條件下，在 β-CD-M1衍生物 HPCE整體柱和空管柱中拆分氧氟沙星對映體，結(jié)果如圖3所示.由圖3可見，手性HPCE整體柱能夠?qū)⒀醴承腔€分離(圖3a)，洗脫強(qiáng)度比較大，分離時間比較短，并且分離度達(dá)到7.72，空的毛細(xì)管柱不能將其分離(圖3b).

圖3 氧氟沙星對映體在不同毛細(xì)管柱下的分離Fig.3 Separation of Ofloxacin with different columns

3 結(jié)語

以雙-(6-氧-間羧基苯磺?；?-β-CD手性HPCE整體柱拆分了手性藥物氧氟沙星，并研究了緩沖液的濃度、酸度、分離電壓對分離情況的影響，建立了新的高效毛細(xì)管電泳手性整體柱拆分氧氟沙星的方法.在pH 4.0，濃度為50 mmol/L的Tris-磷酸緩沖液中進(jìn)樣時間20 s，工作電壓25 kV，檢測波長254 nm條件下，氧氟沙星對映體得到基線分離，分離度達(dá)到7.72.氧氟沙星對照品濃度在(2～6)×10－9g/L范圍內(nèi)，峰高、峰面積與濃度成線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r最高可達(dá)0.9872.經(jīng)7次相同條件的精密度實(shí)驗確定，前峰相應(yīng)信號重現(xiàn)性低于后峰，后峰峰高、峰面積的RSD分別為5.18%和4.40%.

［1］David M L，Trevor G W and Kevin P S.Interpretative reading:recognizing the unusual and inferring resistance mechanisms from resistance phenotypes［J］.J Antimicrob Chemother，2001，48(sup 1):87-102.

［2］Khaldun M A，Bahruddin S，Rohana A，et al.Enantioselectiveanalysis ofofloxacin and ornidazole in pharmaceutical formulations by capillary electrophoresis using single chiral selector and computational calculation of their inclusion complexes［J］.Anal Chim Acta，2010，674(2):249-255.

［3］馬 騫，趙明麗，王柱命，等.氧氟沙星片劑和滴眼液中氧氟沙星對映體的毛細(xì)管電泳拆分及定量分析［J］.分析測試技術(shù)與儀器，2003，9(2):84-87.

［4］Li Yingjie，Song Chunhui，Zhang Lingyi，et al.Fabrication and evaluation of chiral monolithic column modified by β-Cyclodextrin derivatives［J］.Talanta，2010，80(3):1378-1384.

［5］Tian Y，Zhong C，F(xiàn)u E，et al.Novel-cyclodextrin derivative functionalized polymethacrylate-based monolithic columns for enantioselective separation ofibuprofen and naproxen enantiomers in capillary electrochromatography［J］.J Chromatography A，2009，1216(6):1000-1007.

［6］Koide T，Ueno K.Enantiomeric separations of primary amino compounds by capillary electrochromatography with monolithic chiralstationary phasesofchiralcrown ether-bonded negatively charged polyacrylamide gels［J］.J Chromatography A，2001，909(2):305-315.

［7］丁志剛，劉學(xué)群，詹國慶，等.β-CD與間羧基苯磺酰氯及Fe3+構(gòu)筑氧化還原酶［J］.化學(xué)學(xué)報，1995，53:578-582.