王杰，王宇鵬，劉振格，楊鳴發(fā)，林紅麗，田斌，侯喜林

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種高度接觸性傳染病。NDV 屬副粘病毒科、副粘病毒亞科、腮腺炎病毒屬[1-2]，禽副粘病毒Ⅰ型（APMV-Ⅰ），是一種有囊膜的單鏈負(fù)股RNA 病毒。

新城疫病毒的感染能力主要是由兩個(gè)外膜蛋白決定的；一個(gè)是血凝素神經(jīng)氨酸酶（HN），另一個(gè)是融合蛋白（F）。HN 蛋白參與病毒粒子與宿主細(xì)胞表面受體吸附過程，F(xiàn) 蛋白介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜之間發(fā)生融合，進(jìn)而使病毒侵入宿主細(xì)胞，達(dá)到致病的目的[3]。據(jù)報(bào)道，在雞的被動(dòng)免疫過程中，相應(yīng)的單克隆抗體可以直接作用于F 蛋白的2 個(gè)抗原表位，抑制病毒增殖，從而成功的預(yù)防了由該病毒導(dǎo)致的雞的死亡[4]。因此，HN 蛋白和F 蛋白成為目前亞單位疫苗和基因疫苗研究的首選抗原[5-6]。

由于F 蛋白的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，在原核表達(dá)系統(tǒng)中很難獲得全蛋白的高效表達(dá)，所以本研究根據(jù)已知的F 蛋白的3 個(gè)中和抗原表位（第72、161 和343個(gè)氨基酸殘基上），對(duì)NDV LaSota 株F 蛋白基因的三個(gè)抗原表位進(jìn)行分段克隆，期望在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得高效表達(dá)。并對(duì)重組蛋白進(jìn)行檢測(cè)與分析，為以后NDV 的診斷方法和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、菌種、載體

NDV LaSota 弱毒疫苗株購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司（生產(chǎn)批號(hào)：080012040），E.coli DH5α 和BL21（DE3）由本實(shí)驗(yàn)室保存，原核表達(dá)載體pET-30a（+）由本實(shí)驗(yàn)室保存，克隆載體pMD18-T 購(gòu)自于大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑

BamH Ⅰ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)自Promega 公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；NDV 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所，HRP 標(biāo)記的羊抗雞IgG-購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)

參照GenBank 中已發(fā)表的LaSota（登陸號(hào)：AF077761.1）株的F 基因，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，在每對(duì)引物的上、下游5′端加入保護(hù)性堿基和BamH Ⅰ、Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)（酶切位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出），送往上海生工生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如下：

表1 PCR 反應(yīng)引物Table 1 Primers for PCR

1.2 方法

1.2.1 F780和F760片段的擴(kuò)增

提取雞胚尿囊液中（NDV 標(biāo)準(zhǔn)LaSota 株）的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-PCR 擴(kuò)增體系如下：ddH2O 18.3 uL；La Taq Buffer 2.0 uL；dNTP（2.5 mM）2.0 uL；上下游引物各1.0 uL；模板cDNA 0.5 uL；La Taq 0.2 uL。F780反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃40 s，62 ℃40 s，72 ℃40 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。F760反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃40 s，61 ℃40 s，72 ℃45 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果。

1.2.2 PCR 產(chǎn)物的克隆與測(cè)序

PCR 產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒回收目的片段，將回收的目的片段連接到pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂布于LB/AMP+固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，至出現(xiàn)單個(gè)菌落。挑取陽(yáng)性單個(gè)菌落經(jīng)BamHⅠ、Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將實(shí)驗(yàn)室保存的pET30a（+）質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物回收，獲得目的片段。將目的片段與載體片段進(jìn)行連接，采用10 μL 連接體系：10×T4 ligase Buffe 1.0 μL，T4 DNA ligase 0.5 μL，目的片段6.0 μL，pET30a（+）載體2.5 μL。22 ℃水浴連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入BL21 感受態(tài)細(xì)胞中，冰水浴30 min，42 ℃水浴熱休克90 s，立即冰浴2 min，然后加入800 uL 預(yù)熱的LB無抗性液體培養(yǎng)基，37 ℃220 r·min-1搖床上振蕩45～60 min，5 000 r·min-1離心5 min，棄上清，留下約100～200 μL 菌液混勻后，均勻涂于含Kan+的LB 平板上，放置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.2.4 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)

將陽(yáng)性重組菌和空載體分別接入到含Kan+的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.5～0.8時(shí)，在菌液中加入IPTG（終濃度為1 mmol·L-1），進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。分別在誘導(dǎo)后3、5 小時(shí)取出1 mL 菌液，經(jīng)SDS-PAGE 分析，觀察結(jié)果。

1.2.5 Western blot 鑒定

重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳后，將其轉(zhuǎn)移到NC膜上。將轉(zhuǎn)移成功的NC 膜浸入5%脫脂乳中，置于水平搖床上4 ℃封閉過夜，次日用PBST 洗滌3 次；每次10 min，將膜浸入1∶500 稀釋的NDV 多抗血清中，室溫作用2 h，洗滌3 次；將膜浸入以1∶2000 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗雞IgG 中，室溫緩慢振蕩1 h，在DAB 中顯色并觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

利用兩對(duì)特異性引物對(duì)NDV LaSota 疫苗株F基因進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別在705 bp 和624 bp 出現(xiàn)兩條清晰的條帶，與預(yù)期的目的片段大小一致，結(jié)果見圖1。

圖1 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30-F760、pET30-F780 PCR 和雙酶切鑒定結(jié)果

重 組 質(zhì) 粒pET30-F760、pET30-F780經(jīng)BamH I、Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分析后，得到5422 bp 的pET30 載體片段和兩條大小為705 bp 和624 bp 的目的片段（圖2），結(jié)果表明目的片段已經(jīng)克隆到pET30a（+）表達(dá)載體上，成功構(gòu)建了pET30-F760、pET30-F780原核表達(dá)系統(tǒng)。

圖2 重組質(zhì)粒pET30-F760、pET30-F780 的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of pET30-F760、pET30-F780by enzyme digestion

2.3 重組蛋白的SDS-PAGE 結(jié)果

經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，重組蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE分析后，清晰可見大小分別為27.9 kDa 和31.1 kDa的蛋白條帶，大小與目的蛋白的理論值一致（圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒pET30-F760、pET30-F780表達(dá)產(chǎn)物SDS 分析結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE results of the pET30-F760 and pET30-F780 recombinant protein expressed

2.4 重組蛋白的Western blot 鑒定結(jié)果

將經(jīng)過SDS-PAGE 電泳后獲得的目的蛋白條帶轉(zhuǎn)印到NC 膜上，以雞源抗NDV 陽(yáng)性血清作為一抗，以HPR 標(biāo)記的羊抗雞IgG 作為二抗，最后經(jīng)DAB 顯色，在相對(duì)分子量約27.9 kDa 和31.1 kDa 處各出現(xiàn)一條明顯的棕色條帶，與預(yù)計(jì)的目的片段大小一致，而陰性對(duì)照并未出現(xiàn)任何條帶（圖4）該結(jié)果說明表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。

圖4 重組蛋白的Western blot 檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Western blot analysis of the recombinant protein

3 討論

由于NDV F 蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，在原核表達(dá)系統(tǒng)中很難獲得F 基因的全長(zhǎng)表達(dá)。冉旭華[7]曾嘗試將NDV F48E8 株的完整的F 蛋白進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果沒有成功。孫淑娜[8]也曾嘗試表達(dá)LaSota 株的F 蛋白，卻得到了同樣的結(jié)果。在后續(xù)的研究中張桂芝將（F48E9）的F 蛋白去掉了N 端信號(hào)肽和C 端跨膜區(qū)，并根據(jù)F 蛋白已知的三個(gè)抗原表位的位置，分別位于第72、161 和343 個(gè)氨基酸殘基上，將F 蛋白分成兩段進(jìn)行原核表達(dá)。程寶艷[9]則將三個(gè)抗原表位分別單獨(dú)表達(dá)，結(jié)果二者都成功的獲得了截?cái)嗟鞍椎母咝П磉_(dá)。研究對(duì)NDV LaSota 株F 蛋白基因的三個(gè)抗原表位進(jìn)行了分段克隆，通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。成功的獲得的截?cái)嗟鞍椎母咝П磉_(dá)。并通過研究了解NDV 部分抗原表位的特點(diǎn)，為以后NDV F 蛋白在亞單位疫苗方面的研究奠定基礎(chǔ)。

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