趙 靜，王 軍，陳 洋，鄭立雙，孫城濤，呂文發(fā)

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春130118；2.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州121001）

肌肉生成抑制素（MSTN）屬轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF－β）超家族成員，是骨骼肌發(fā)育的負(fù)調(diào)可溶性mystatin節(jié)因子［1－3］。在哺乳動物體內(nèi)，MSTN 能夠抑制肌細(xì)胞的增殖和分化［4－6］。目前有研究發(fā)現(xiàn)，受體、myostatin前肽、卵泡抑素及其相關(guān)多肽和蛋白質(zhì)、myostatin阻斷抗體、RNA干涉及其他一些化學(xué)抑制劑［2］，通過主動免疫方式抑制MSTN前體蛋白成熟化，從而抑制活性MSTN蛋白二聚體的形成，最終抑制MSTN的生物活性，從而導(dǎo)致肌肉的快速增長，但是有關(guān)體內(nèi)MSTN生物學(xué)功能的調(diào)控機(jī)制目前還未闡明。蛋白質(zhì)是細(xì)胞活性及功能的最終執(zhí)行者，研究MSTN相互作用蛋白不僅對闡明MSTN的調(diào)控機(jī)制具有重要意義，而且也為開發(fā)MSTN功能調(diào)控技術(shù)和產(chǎn)品提供新的方向。酵母雙雜交系統(tǒng)是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)，可以高通路的篩選細(xì)胞內(nèi)相互作用蛋白，是發(fā)現(xiàn)相互作用新蛋白的一種強(qiáng)有力的手段［7，9］。本試驗利用酵母雙雜交技術(shù)對牛MSTN相互作用蛋白進(jìn)行了篩選并應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)對篩選蛋白進(jìn)行體內(nèi)驗證，為闡明MSTN生物學(xué)功能的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 大腸桿菌KC8，酵母菌Y2HGold，pGEX－4T－l和pcDNA 3.0－Flag載體均由本實驗室保存；pGBKT7和pGADT7質(zhì)粒、酵母雙雜交系統(tǒng)Make Your Own“Mate ＆ Plate”Library System（Cat.No.630490）試劑盒，購自Clontech公司；酵母培養(yǎng)基所需各種氨基酸，購自美國Amresco公司；人胚胎腎細(xì)胞（293T）由本實驗室保存，抗Flag標(biāo)簽的單克隆抗體偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠珠（anti－Flag M2－Agarose）等，購自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmine2 000，購自Invitrogen公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及自激活和毒性檢測 根據(jù)GenBank上公布的牛MSTN成熟片段mRNA序列設(shè)計引物，上游引物引入ECORⅠ酶切位點：5′－TCGGAATTCGATTTTGGGCTTGATTGTGAT－GAAC－3′，下 游 引 物 引 入 PSTⅠ 酶 切 位 點：5′－CGCTGCAGTCATGAACACCCACAGCGATC－3′，對pMD18－T－MSTN重組載體和pGBKT7質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，利用SolutionⅠ連接液定向連接，構(gòu)建pGBKT7－MSTN誘餌質(zhì)粒，對獲得的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序分析比對。將構(gòu)建好的含誘餌載體pGBKT7－MSTN的Y2HGold酵母菌作為試驗組，含載體pGBKT7－53的Y2H酵母菌作為陽性對照組，空Y2HGold酵母菌作為陰性對照組，涂布接種于 SD／－Trp－His、SD／－Trp－Leu、SD／－Trp／－Leu／－Ade／－His平板上，30℃倒置培養(yǎng)3～5d，觀察菌落的生長情況。再分別將轉(zhuǎn)有空載體pGBKT7的Y2H酵母菌和試驗組接種于SD／－Trp的液體培養(yǎng)基中過夜振蕩培養(yǎng)，用紫外分光光度計測量其OD600值。

1.3 牛肌肉cDNA文庫的篩選 挑取在SD／－Trp固體培養(yǎng)基上生長大于2mm含有pGBKT7－MSTN質(zhì)粒的Y2HGold酵母菌落，接種于SD／－Trp液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)16h～24h，當(dāng)OD600值達(dá)到0.8時，與含有牛肌肉cDNA文庫的Y187酵母菌交配融合，交配18h～24h后，觀察交配情況，離心收集菌液，將菌液用玻璃珠涂布于SD／－Trp／－Leu／－His／－Ade平板上初步篩選陽性克隆，30℃倒置培養(yǎng)3～8d。同時取樣品100μL梯度稀釋濃度分別為：10－1、10－2、10－3、10－4；分別涂布在SD／－Trp，SD／－Leu，SD／－Trp－Leu平板上計算融合效率。

1.4 文庫陽性克隆的鑒定分析 初步篩選的陽性克 隆 劃 線 于 SD／－Trp／－Leu／－His／－Ade 平 板 上，30℃倒置培養(yǎng)3～8d。挑取生長旺盛的菌落進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定成功的菌落接種于SD－Leu液體培養(yǎng)基中并提取質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌KC8送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序并將質(zhì)?；剞D(zhuǎn)酵母驗證，測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對、分析。

1.5 免疫共沉淀 將293T細(xì)胞在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長到90%～95%融合度時開始轉(zhuǎn)染；在轉(zhuǎn)染前1天，將細(xì)胞傳代至直徑6cm細(xì)胞培養(yǎng)板上。每孔加不含抗生素培養(yǎng)基DMEM 2 mL，將準(zhǔn)備好的滅菌的蓋玻片放入培養(yǎng)孔里，取構(gòu)建成功的pLEGFP－MSTN 與pcDNA 3.0－Flag－T－cap重組質(zhì)粒各5μg加入到250μL的DMEM（無血清、無抗生素）中為溶液1，再取同樣的250μL的DMEM加入10μL lipofectamineTM2 000混勻，室溫靜置5min為溶液2，將溶液1和溶液2混合，室溫條件下靜置30min；將混合均勻的溶液1與溶液2逐滴加入孔中，輕輕混勻，于5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)，6h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)18h～42 h；收細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗2次，用1mL PBS懸浮細(xì)胞至1.5mL的離心管中，2 500r／min離心5 min，留上清；加500μL細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞；小探頭超聲細(xì)胞裂解液后，12 000r／min（4℃）離心10 min，取含相等量蛋白的上清加入25μL抗Flag標(biāo)簽的單克隆抗體偶聯(lián)的瓊脂糖凝膠珠懸液中，4℃緩慢搖晃孵育過夜，回收凝膠珠，再用裂解液洗滌3遍以上凝膠珠，在4℃條件下旋轉(zhuǎn)孵育5h，3 000r／min（4℃）離心5min，將上清小心吸去，最終沉淀用20μL 2×SDS上樣緩沖液懸浮煮沸10min，12 000 r／min離心1min。用抗GFP和Flag標(biāo)簽蛋白的兩種單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡分析（Westem－blot）。

2 結(jié)果

2.1 誘餌質(zhì)粒pGBKT7－MSTN構(gòu)建及自激活和毒性檢測分析 以pGBKT7－MSTN質(zhì)粒為模板做PCR，并做雙酶切獲得7 600bp載體片段和330bp目的片段（見圖1），送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序結(jié)果正確，表明pGBKT7－MSTN誘餌重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將含有誘餌質(zhì)粒的pGBKT7－MSTN的 Y2HGold酵母菌 涂布在 SD／－Trp－His、SD／－Trp－Leu、SD／－Trp／－Leu／－Ada／－His平板培養(yǎng)基上都無菌落生長，且陽性對照組出現(xiàn)菌落，說明誘餌蛋白不能自激活。將試驗組與轉(zhuǎn)有空載體pGBKT7的Y2HGold酵母菌分別接種于SD／－Trp液體培養(yǎng)基中30℃振蕩培養(yǎng)過夜后，OD600值分別為0.813和0.809無明顯差別，說明構(gòu)建的誘餌蛋白對宿主酵母菌無毒性。

2.2 陽性克隆篩選 酵母融合18h～20h后，取1滴菌液于載玻片上，置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，酵母出現(xiàn)了三葉草狀二倍體融合細(xì)胞，說明雜交融合成功。4個稀釋度分別涂布接種于SD／－Trp、SD／－Leu、SD／－Trp／－Leu平板上，按照公式：融合率 ＝（SD／－Trp／－Leu菌落數(shù)）／（SD／－Trp和 SD／－Leu中較少的菌落數(shù)）計算融合率為16%，符合文庫篩選要求。篩選出的陽性克隆在SD／－Leu／－Trp／－His／－Ade平板上反復(fù)篩選3次，得到3個陽性克隆，將這3個陽性克隆進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗證，得到一個陽性克?。▓D2），再將得到的陽性克隆轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行測序分析，與NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)該基因與家牛titin－cap蛋白同源性高達(dá)99%，GenBank登錄號為NM＿001014915.1。

圖1 誘餌重組質(zhì)粒pGBKT7－MSTN

圖2 酵母雙雜交分析陽性克隆

2.3 通過免疫共沉淀驗證MSTN和T－cap在體內(nèi)的相互作用 用抗Flag抗體偶聯(lián)的瓊脂糖珠子結(jié)合，免疫沉淀帶有Flag標(biāo)簽的T－cap，再用GFP抗體做 Western－blot分析，檢測免疫沉淀物中是否有GFP－MSTN。結(jié)果如圖3，MSTN和T－cap可以在哺乳動物細(xì)胞中特異的結(jié)合，而GFP不會與T－cap結(jié)合。結(jié)果證明，MSTN和T－cap能夠在哺乳動物細(xì)胞中特異的結(jié)合。

3 討論

MSTN是近年來發(fā)現(xiàn)的一個重要的肌細(xì)胞生長調(diào)控因子，其主要功能是負(fù)向調(diào)控肌細(xì)胞生長發(fā)育，對該基因的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，有兩種雙肌牛骨骼肌中編碼肌生成抑制素的遺傳密碼發(fā)生了突變［，9］，用基因打靶敲除GDF－8基因，制備了基因缺失小鼠，其骨骼肌的重量是普通小鼠的2～3倍以上［10］。因此通過抑制MSTN活性來增加畜禽肌肉量及在醫(yī)學(xué)上的疾病治療將是一個非常重要的研究。有研究發(fā)現(xiàn)，相互作用蛋白之間能夠結(jié)合形成復(fù)合物，使某一蛋白處于非活性狀態(tài)，因而從相互作用蛋白角度研究MSTN，能為MSTN生物學(xué)功能的調(diào)控打開新的思路。

酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用的一項有效技術(shù)，使用此種方法可以篩選與某一已知蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用的新成員。本研究利用酵母雙雜交體系從牛肌肉cDNA中篩選與MSTN相互作用的蛋白，經(jīng)2輪嚴(yán)格篩庫，排除了假陽性，得到3個陽性克隆，經(jīng)測序分析blast比對證實為1個基因，其余為相同序列或同源性較接近序列。本研究也通過免疫共沉淀技術(shù)對MSTN與T－cap進(jìn)行相互作用驗證，排除酵母雙雜交存在的假陽性可能。

對篩選得到的MSTN相互作用蛋白進(jìn)行功能分析，T－cap是一個19kDa的肌蛋白，最初被確定在骨骼肌中含量最為豐富［11］。據(jù)報道，T－cap在肌原纖維生成和肌纖維翻轉(zhuǎn)過程中參與細(xì)胞骨架重組［12］，表明它在肌節(jié)蛋白的結(jié)構(gòu)融合中起重要作用，是肌節(jié)的結(jié)構(gòu)完整性所必要的［13］，有研究結(jié)果表明，T－cap在Z－拉鏈區(qū)域內(nèi)起著連接肌原纖維與肌原纖維膜的作用［14］。MSTN蛋白以自分泌方式依賴劑量效應(yīng)對肌纖維的增長分化起抑制作用。Zheng等［15］在C2C12成肌細(xì)胞中過度表達(dá) T－cap蛋白，成肌細(xì)胞中 MSTN的濃度非常低，說明T－cap蛋白對MSTN起到一定的抑制作用。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)的T－cap蛋白能夠抑制 MSTN功能，但這個蛋白是如何與MSTN發(fā)生相互作用，通過什么機(jī)制來發(fā)揮作用，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本試驗中，我們利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出與牛MSTN有相互作用的T－cap蛋白，并通過免疫共沉淀試驗驗證了二者之間存在相互作用，為探索MSTN蛋白功能和作用機(jī)理提供了新的方向。

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