黃燕，張贏予，王好，周艷芳，張國輝，芮濤

(江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病的常見并發(fā)癥，其臨床診斷是基于糖尿病患者獨(dú)立于冠心病、高血壓和乙醇性心肌病等出現(xiàn)心功能不全［1］。心肌纖維化是糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展過程中共同的、標(biāo)志性的病理特征。心肌纖維化主要是心肌成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白增加，如Ⅰ型膠原蛋白(collagenⅠ)，Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅲ)［2］。微小RNA(microRNA)是由18～24個(gè)核苷酸組成的非編碼的小分子RNA，通過與靶mRNA的3'-UTR區(qū)域的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合而抑制靶mRNA的翻譯或促進(jìn)該mRNA的降解從而降低目標(biāo)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)功能［3］。以往研究表明，miR-375直接調(diào)節(jié)胰腺β細(xì)胞胰島素的分泌，其表達(dá)與糖尿病的形成密切相關(guān)［4］。本研究旨在檢測(cè)糖尿病狀態(tài)下心肌成纖維細(xì)胞中miR-375的表達(dá)，同時(shí)探討miR-375在糖尿病心肌纖維化中的可能作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和主要試劑

C57BL/6小鼠，2～4周齡，雌雄不限，由江蘇大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。DMEM(高糖及低糖)購自美國Gibco公司;標(biāo)準(zhǔn)小牛血清購自美國Hyclone公司，胰酶購自美國Sigma公司;細(xì)胞RNA提取試劑盒，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR試劑盒，小鼠 miR-375引物，RNU6B購自QIAGEN公司;小鼠miR375抑制劑(熒光素標(biāo)記)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;轉(zhuǎn)染試劑，無血清培養(yǎng)基購自Invitrogen公司;免疫組化試劑盒購自北京厚德生物科技有限公司;波形蛋白(vimentin)一抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及傳代脫頸法處死C57BL/6小鼠，75%乙醇消毒2次，無菌條件下取出心臟，將其剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的組織塊，用無Ca2+-Mg2+的Hank's緩沖液清洗組織塊，0.08%胰酶加0.06%膠原酶37℃水浴消化，收集消化后的上清并用含20%血清的低糖(5 mmol/L)DMEM中和，直至組織塊變透明終止消化。將收集的細(xì)胞離心重懸，接種至10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，差速貼壁法除去未貼壁的其他細(xì)胞，用含10%小牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞長滿至培養(yǎng)皿的70%～80%時(shí)，用0.25%胰酶消化按1∶2的比例進(jìn)行傳代。

1.2.2 心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及鑒定 倒置顯微鏡下觀察第2代心肌成纖維細(xì)胞的形態(tài)。取第2代的心肌成纖維細(xì)胞采用免疫組化法進(jìn)行波形蛋白鑒定，波形蛋白陽性率作為心肌成纖維細(xì)胞純度鑒定的指標(biāo)，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)20～30個(gè)細(xì)胞，計(jì)算波形蛋白陽性細(xì)胞的比例。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞中miR-375的表達(dá) 心肌成纖維細(xì)胞分為2組，即對(duì)照組和高糖處理組，對(duì)照組采用5 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)，高糖處理組采用25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)。利用細(xì)胞RNA提取試劑盒提取總RNA，DEPC水溶解獲得的RNA，核酸蛋白分析儀(Beckman Coulter，USA)檢測(cè) RNA濃度及純度;RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;構(gòu)建miR-375和RNU6B的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系(20 μL):實(shí)時(shí)定量PCR 混合試劑10 μL、通用引物2 μL、去核糖核酸酶水 4 μL、小鼠 miR-375 引物2 μL、cDNA 模板2 μL;反應(yīng)條件:95 ℃變性15 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本均作復(fù)管PCR反應(yīng)，至少重復(fù)2次(實(shí)時(shí)定量PCR儀采用Bio-rad CFX96)。采用RNU6B作為內(nèi)參照，用RNU6B的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，通過Light Cycler軟件直接獲得各個(gè)樣本中miR-375的ΔCt值;以對(duì)照組的 ΔCt值作為校正，得出 － ΔΔCt，按目的基因表達(dá)量 =2－ΔΔCt公式計(jì)算各個(gè)樣本中miR-375的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 miR-375抑制劑轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞 在37℃、5%CO2孵育箱中，以含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)心肌成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前以胰酶消化心肌成纖維細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，以105/mL接種于6孔板中，待細(xì)胞的融合率達(dá)到80%左右時(shí)，換為不含血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，饑餓細(xì)胞6 h，按照說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染miR-375抑制劑陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染6 h后，換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 免疫組化檢測(cè)各組心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá) 心肌成纖維細(xì)胞按105/mL接種于置有無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞爬片，細(xì)胞貼壁后，用高糖培養(yǎng)基處理6 h，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-375抑制劑;轉(zhuǎn)染48 h后采用免疫組化試劑盒檢測(cè)Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)。操作步驟:PBS漂洗，3%H2O2-甲醛處理，PBS漂洗，血清封閉，一抗(1∶200，PBS稀釋)孵育過夜，PBS漂洗，二抗孵育，PBS漂洗，SABC孵育，PBS漂洗，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木青復(fù)染，自來水沖洗，脫水、透明、封片、鏡檢。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。200倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)20～30個(gè)細(xì)胞，計(jì)算Ⅰ型膠原蛋白陽性細(xì)胞的比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6小鼠心肌成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及純度鑒定

在倒置顯微鏡下觀察，心肌成纖維細(xì)胞呈梭形，多角形，細(xì)胞質(zhì)透明，細(xì)胞核大，呈橢圓形，常含有2～3個(gè)核。培養(yǎng)第2代的心肌成纖維細(xì)胞波形蛋白鑒定，心肌成纖維細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色，即表達(dá)陽性，非心肌成纖維細(xì)胞表達(dá)陰性，結(jié)果顯示心肌成纖維細(xì)胞純度達(dá)90%。見圖1。

圖1 免疫組化染色鑒定心肌成纖維細(xì)胞純度(×400)Fig 1 The purity of cardiac fibroblasts evaluated by immunohistochemical staining with vimentin

2.2 高糖對(duì)心肌成纖維細(xì)胞中miR-375表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，心肌成纖維細(xì)胞經(jīng)高糖處理6，12，24 h后，miR-375表達(dá)增加(F=91.263，P＜0.05)，均顯著高于對(duì)照組(P均＜0.05)，見圖2。

圖2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-375的差異性表達(dá)Fig 2 The different expression of miR-375 in cardiac fibroblasts detected by qRT-PCR

2.3 miR-375抑制劑的轉(zhuǎn)染效率

熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-375抑制劑轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞的效率約70%，見圖3。心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后用于實(shí)驗(yàn)。

圖3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-375抑制劑轉(zhuǎn)染效率Fig 3 The transfection efficiency of miR-375 inhibitor detected by qRT-PCR

2.4 miR-37抑制劑對(duì)高糖處理心肌成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響

免疫組化Ⅰ型膠原蛋白陽性心肌成纖維細(xì)胞胞質(zhì)呈棕褐色。Ⅰ型膠原蛋白陽性率=Ⅰ型膠原蛋白陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。免疫組化結(jié)果表明，miR-375抑制劑組的心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白陽性表達(dá)率(37.84±3.34)%顯著低于miR-375抑制劑陰性對(duì)照組的(76.20±6.96)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.346，P ＜0.05)。見圖4。

圖4 免疫組化染色檢測(cè)心肌成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)(×200)Fig 4 Expression of collagenⅠin cardiac fibroblasts evaluated by immunohistochemical staining

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致糖尿病患者致殘率和致死率較高的主要原因。其發(fā)病機(jī)制至今未明，對(duì)該病的治療仍缺乏有效手段。心肌纖維化是糖尿病心肌病的病理性改變之一。心肌纖維化是心肌成纖維細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如Ⅰ型膠原蛋白﹑Ⅲ型膠原蛋白等增加，進(jìn)而在心肌細(xì)胞間隙沉積，導(dǎo)致心室壁僵硬，順應(yīng)性下降，影響心室的舒張和收縮功能，最終導(dǎo)致心力衰竭，甚至死亡。近年來，在探索心肌纖維化發(fā)生機(jī)制的過程中，微小RNA的作用引人關(guān)注。微小RNA是一類非編碼的小分子RNA，通過與靶mRNA特異性以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合，促進(jìn)靶mRNA的降解或抑制該mRNA的翻譯而發(fā)揮其生物學(xué)功能［3］。微小RNA在許多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、癌癥發(fā)生等。最近研究表明，微小RNA也參與調(diào)控心血管系統(tǒng)的發(fā)育和疾病發(fā)生過程。目前已經(jīng)證明miR-133和miR-30通過靶向作用于結(jié)締組織生長因子，一種關(guān)鍵的促纖維化蛋白，而參與心肌纖維化的形成［5］。另外，也已證明在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎的心肌梗死小鼠模型中miR-29的表達(dá)下降與膠原蛋白的表達(dá)增加相關(guān)，所以被認(rèn)為參與心肌纖維化［6］。Feng等［7］發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌 miR-133表達(dá)下降導(dǎo)致糖尿病小鼠心肌肥厚。

本課題組前期通過微陣基因序列檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病小鼠的心肌有多個(gè)微小RNA的表達(dá)上調(diào)，其中包括 miR-375，miR-99a，miR-133a等。miR-375最初被發(fā)現(xiàn)在胰腺胰島中表達(dá)，調(diào)節(jié)胰島素的分泌和葡萄糖的代謝［8］，影響胰腺α和β細(xì)胞的質(zhì)量并參與胰腺癌的發(fā)展［8－10］。最近報(bào)道 miR-375與腫瘤的發(fā)展有關(guān)，其在一些惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)如肝癌、胃 癌［11－13］，頭 頸 部 鱗 狀 細(xì) 胞 癌［14－15］、胰 腺癌［16］。但到目前為止，miR-375調(diào)節(jié)糖尿病心肌纖維化相關(guān)的蛋白表達(dá)，參與糖尿病心肌纖維化的發(fā)生和發(fā)展尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)C57BL/6小鼠的心肌成纖維細(xì)胞經(jīng)高糖處理制成DCM模型，發(fā)現(xiàn)心肌成纖維細(xì)胞經(jīng)高糖處理6，12，24 h后，miR-375的表達(dá)均顯著增加，這一研究結(jié)果表明糖尿病高血糖影響心肌成纖維細(xì)胞miR-375的表達(dá);另外，高糖處理的心肌成纖維細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-375抑制劑抑制miR-375表達(dá)后，胞質(zhì)中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)顯著降低，這提示，miR-375在糖尿病心肌纖維化中起一定的作用，其具體的作用機(jī)制尚不清楚。基于生物信息工具，miR-375靶向作用于IL-33的3'-UTR，而新近研究報(bào)道IL-33具有抗纖維化的作用。因此，我們推測(cè)miR-375可能通過靶向作用于IL-33參與糖尿病心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。為研究miR-375在糖尿病心肌病心肌纖維化中的確切機(jī)制，需明確高血糖是否能導(dǎo)致心肌成纖維細(xì)胞IL-33的表達(dá)下調(diào)從而促進(jìn)心肌纖維化的發(fā)生，以及IL-33mRNA 3-UTR是否為miR-375的靶標(biāo)。

本研究結(jié)果提示miR-375在糖尿病心肌纖維化中起一定的作用，為探討糖尿病心肌病心肌纖維化發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，對(duì)糖尿病心肌病心肌纖維化的治療提供了新的理論依據(jù)。

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