尹儉儉，李秀景，鄭叢龍

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連116622)

副流感病毒(parainfluenza virus，PIV)屬于副黏病毒科，為負(fù)單鏈RNA病毒，主要存在于呼吸道分泌物內(nèi)，是引發(fā)嬰幼兒呼吸道感染的重要病原體。其中，3型副流感病毒(PIV-3)僅次于呼吸道合胞病毒，能夠引發(fā)6個月以下嬰幼兒肺炎、支氣管炎［1］。當(dāng)感染PIV時，體內(nèi)可產(chǎn)生局部抗體和血清抗體，但這樣獲得的免疫力較差，且嬰幼兒抗體應(yīng)答能力相對較弱，持續(xù)時間短，容易反復(fù)感染。對此，國內(nèi)外還沒有特別有效的抗PIV治療藥物。因此，需要研發(fā)有效的藥物應(yīng)對PIV的潛在威脅。納米銀是將納米技術(shù)與金屬銀本身的抗菌防腐作用相結(jié)合而成的，已廣泛應(yīng)用于生物傳感、食品工業(yè)、化妝品和醫(yī)療設(shè)備［2］，在醫(yī)學(xué)臨床領(lǐng)域，也具有較好的抗菌效果［3］。近些年來，有關(guān)納米銀抗病毒作用已有報道，其對人類免疫缺陷病毒、乙肝病毒和流感病毒等有明顯的抑制作用［4－6］。有關(guān)納米銀抗PIV作用及機(jī)制的研究報道較少，本文主要應(yīng)用MTT法、透射電鏡技術(shù)，神經(jīng)氨酸酶活性抑制實驗和小鼠體內(nèi)實驗來初步探討納米銀抗PIV3的可能機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和病毒株 傳代細(xì)胞:狗腎細(xì)胞(MDCK)用于分離和培養(yǎng)PIV，購于大連市疾病預(yù)防和控制中心，經(jīng)本實驗室傳代后保存，并用含10%胎牛血清的DMEM傳代培養(yǎng)。病毒株:PIV3(血凝效價為1∶1 024)，購自中國科學(xué)研究院武漢病毒研究所，經(jīng)本實驗室接種后凍存。

1.1.2 實驗動物 清潔級ICR小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(遼)2008-0002。

1.1.3 主要試劑和試劑盒 DMEM:美國Gibco公司;納米銀溶液:由大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究組應(yīng)用化學(xué)還原法制得，質(zhì)量濃度為400 mg/L，顆粒平均粒徑約為10 nm，室溫保存6個月無沉積現(xiàn)象發(fā)生;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT):美國Sigma;二甲基亞砜(DMSO):上海生工;免疫熒光試劑盒:英國Dako Cytomation;神經(jīng)氨酸酶活性檢測試劑盒:江蘇碧云天;2%磷鎢酸負(fù)染液(pH=6.5):北京中鏡科儀;乙醚:北京化工廠分析純(純度≥99.5%)。

1.1.4 主要儀器 酶標(biāo)儀:瑞士TECAN;NU-5500E二氧化碳培養(yǎng)箱:NUAIR;BCN-1360B生物潔凈工作臺:北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;CKX44倒置顯微鏡、熒光顯微鏡:日本Olympus。

1.2 方法

1.2.1 PIV3毒力測定 用DMEM細(xì)胞維持液將PIV3依次作 10 倍系列稀釋，配制得 10－1、10－2、10－3、10－4、10－55 個不同梯度的病毒液。按 100 μL/孔分別加至已鋪滿單層MDCK細(xì)胞的96孔板中，每個劑量設(shè)置6個復(fù)孔，同時設(shè)正常細(xì)胞對照，將其置于37℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)2 h，棄去上清，PBS吹洗3遍，補加細(xì)胞維持液100 μL/孔繼續(xù)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下每日觀察，連續(xù)觀察6 d，培養(yǎng)結(jié)束棄去上清，PBS洗滌3次，按25 μL/孔加 MTT，放置在37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)4 h，棄上清后加入DMSO 150 μL/孔，置入酶標(biāo)儀中，內(nèi)部震蕩混勻15 min后測光密度D(492 nm)，實驗重復(fù)3次。計算各組細(xì)胞存活率，根據(jù)Reed-Muench法，距離比例=(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)－50%)/(高于50%病變率的百分?jǐn)?shù)－低于50%病變率的百分?jǐn)?shù))，lg半數(shù)感染劑量(TCID50)=距離比例×稀釋度對數(shù)之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)，計算PIV3的TCID50。

1.2.2 不同途徑下納米銀體外對PIV3感染MDCK的抑制作用

1.2.2.1 納米銀對PIV3的直接滅活作用(直接滅活組) 先將25 mg/L的納米銀與等體積100 TCID50的PIV3液充分混合作用2 h，取混合液按100 μL/孔加至長滿單層MDCK的培養(yǎng)板，37℃，5%CO2孵育2 h，棄上清，PBS吹洗3次，加細(xì)胞維持液100 μL/孔繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。細(xì)胞存活率檢測方法同上。

1.2.2.2 納米銀對PIV3吸附和侵入MDCK的阻斷作用(預(yù)防給藥組) 將25 mg/L納米銀按100 μL/孔加至長滿單層MDCK的培養(yǎng)板，孵育2 h，棄上清，PBS吹洗3次;然后將100 TCID50的 PIV3液按100 μL/孔加入上述處理的培養(yǎng)板，37℃，5%CO2吸附2 h，棄上清，PBS吹洗3次，最后加細(xì)胞維持液100 μL/孔繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。當(dāng)病毒對照組細(xì)胞形態(tài)變化達(dá)75%以上時，采用MTT法檢測各組細(xì)胞的存活率。

1.2.2.3 納米銀對PIV3子代病毒體增殖的抑制作用(治療給藥組) 將100 TCID50的PIV3液按100 μL/孔加至長滿單層MDCK的培養(yǎng)板，充分吸附2 h，棄病毒液，PBS吹洗3次，再將25 mg/L的納米銀溶液按100 μL/孔加入上述處理的培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2孵育2 h，棄上清，PBS吹洗3次，補加維持液100 μL/孔繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。細(xì)胞存活率檢測方法同上。

同時設(shè)正常細(xì)胞組、病毒對照組、納米銀對照組，每個質(zhì)量濃度設(shè)置6個復(fù)孔，MTT法檢測細(xì)胞存活率，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 免疫熒光法檢測納米銀在MDCK內(nèi)對PIV3的抑制作用 待MDCK在附有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中長至75%左右時，按照上述3種不同途徑處理MDCK后進(jìn)行免疫熒光檢測。當(dāng)病毒對照組細(xì)胞形態(tài)顯示明顯病變時(達(dá)75%以上)，取出蓋玻片，用冰浴上的PBS吹洗3次，4℃預(yù)冷丙酮固定30 min，PBS吹洗3次，滴加30 μL免疫染色封閉液，37℃孵育30 min，PBS吹洗3次，然后再滴加30 μL用FITC標(biāo)記的抗體于各蓋玻片上，37℃孵育30 min，取下蓋玻片，PBS吹洗3次，用濾紙吸干薄片邊緣液體，封片液封片，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.4 神經(jīng)氨酸酶活性抑制實驗 PIV3的神經(jīng)氨酸酶活性可以通過神經(jīng)氨酸酶抑制實驗來檢測［7］。按照試劑盒要求操作，病毒液在室溫條件下分別與75 mg/L和37.5 mg/L的納米銀作用30 min和60 min，同時設(shè)陽性對照和陰性對照，加入熒光酶作用底物充分混勻，37℃ 孵育10 min。設(shè)定激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為355 nm和460 nm，測定熒光強度值，并計算神經(jīng)氨酸酶活性的抑制百分率。

1.2.5 透射電鏡負(fù)染色法觀察納米銀對PIV3粒子的破壞作用 將150 mg/L納米銀與PIV3液等體積混合，兩者充分作用30，60和120 min;鑷子夾住銅網(wǎng)邊緣并浸沒于上述樣品中靜置20 min;夾出，用濾紙將銅網(wǎng)邊緣吸去懸液，自然晾干至肉眼看不到殘留液后，將銅網(wǎng)浸沒于磷鎢酸負(fù)染液中靜置3～5 min;干燥后用透射電鏡觀察。

1.2.6 納米銀對小鼠PIV感染治療的作用效果

1.2.6.1 分組 將小鼠隨機(jī)分成5組:正常對照組、陽性對照組、納米銀對照組、病毒對照組和納米銀治療組(納米銀質(zhì)量溶度為400 mg/L)，每組8只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。

1.2.6.2 納米銀治療組動物模型的建立和肺組織病理學(xué)檢查 小鼠經(jīng)乙醚麻醉，當(dāng)進(jìn)入麻醉狀態(tài)且用鼻呼吸急促時，迅速進(jìn)行滴鼻。正常對照組和納米銀對照組滴鼻40 μL生理鹽水，陽性對照組、病毒對照組和納米銀治療組滴鼻40 μL PIV3液。滴病毒液4 h后進(jìn)行治療:病毒照組和正常對照組滴生理鹽水40 μL，納米銀治療組和納米銀對照組滴納米銀40 μL，陽性對照組采用利巴韋林口服藥灌胃，此為第1次治療。此后每隔24 h按此操作進(jìn)行1次治療，總計3次。4 d后無菌剖取肺組織，用10%甲醛固定作病理切片，于光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米銀對MDCK的毒性作用及PIV3的毒力

納米銀對MDCK作用的最大無毒質(zhì)量濃度(TC0)為 25 mg/L［8］，PIV3 對 MDCK 細(xì)胞作用的TCID50為10－1.35/mL。當(dāng)納米銀濃度大于 25 mg/L后，則開始抑制MDCK生長。納米銀對MDCK的毒性作用主要表現(xiàn)為細(xì)胞顆粒增多，大小不均，增殖緩慢，細(xì)胞回縮、變圓、成串脫落死亡。納米銀對細(xì)胞的毒性作用隨著納米銀溶液質(zhì)量濃度的降低而降低，細(xì)胞存活率相應(yīng)增加。

2.2 MTT法檢測納米銀對PIV3的抑制作用

結(jié)果表明，納米銀處理組(直接滅活組，預(yù)防給藥組，治療給藥組)的細(xì)胞存活率與病毒對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表1。

表1 不同組MTT檢測結(jié)果的比較±sTab 1 Comparison of MTT assay results in different groups

表1 不同組MTT檢測結(jié)果的比較±sTab 1 Comparison of MTT assay results in different groups

a:P ＜0.01，與病毒對照組比較

組別 MTT值 細(xì)胞存活率/%直接滅活組 0.8273 ±0.04 94.81 ±0.02a預(yù)防給藥組 0.8120 ±0.04 93.05 ±0.05a治療給藥組 0.7882 ±0.01 90.32 ±0.02a正常細(xì)胞組 0.8727±0.04 —病毒對照組 0.2470 ±0.05 25.50 ±0.06納米銀對照組 0.8308 ±0.03 95.21 ±0.04 F 值 361.542 332.327 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.3 免疫熒光法檢測納米銀對PIV3的抑制作用

待MDCK在置有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板上鋪滿單層后，將納米銀和PIV3作不同的處理，封片，于倒置顯微鏡下觀察。如圖1所示，正常MDCK組未見特異性黃綠色熒光，細(xì)胞形態(tài)正常;病毒對照組和溶劑對照組(溶劑與PIV3混合組)中，MDCK均出現(xiàn)了很強的特異性黃綠色熒光，細(xì)胞腫脹變圓、間隙增大、細(xì)胞死亡或脫落;預(yù)防用藥組、直接滅活組、治療用藥組的細(xì)胞內(nèi)特異性熒光均很少見，細(xì)胞形態(tài)變化不大，細(xì)胞稍微回縮，但形態(tài)基本正常。

圖1 不同組細(xì)胞的免疫熒光法檢測結(jié)果Fig 1 Immunofluorescence analysis of cells in different groups

MTT和免疫熒光的結(jié)果表明，納米銀能明顯抑制PIV3的復(fù)制和子代病毒的合成，對PIV3的侵入有一定的阻斷作用，對PIV3及其吸附有破壞作用。

2.4 納米銀對神經(jīng)氨酸酶活性的抑制

不同質(zhì)量濃度的納米銀(75 mg/L和37.5 mg/L)分別與PIV3相互作用30 min和60 min，再孵育10 min，納米銀對PIV3神經(jīng)氨酸酶活性的抑制率均高于80%，而病毒對照組和溶劑對照組的抑制率均低于20%(圖2)。神經(jīng)氨酸酶催化唾液酸與糖蛋白之間糖苷鍵的水解，協(xié)助病毒顆粒穿過呼吸道黏液和促進(jìn)子代病毒體脫離于感染細(xì)胞［9］。上述結(jié)果表明，納米銀可以通過作用于PIV3神經(jīng)氨酸酶藥物靶點來阻斷病毒對細(xì)胞的感染。

2.5 納米銀對PIV3粒子的破壞作用

PIV3液經(jīng)透射電鏡負(fù)染色后，可觀察到正常PIV3顆粒，自外而內(nèi)可見清晰的包膜和基質(zhì)，符合PIV3的形態(tài)特征。PIV3與納米銀相互作用30 min后，其形態(tài)部分缺損;相互作用60 min，結(jié)構(gòu)完全被破壞;作用120 min，病毒被破壞成更小的碎片，形態(tài)已無法觀察。見圖3。結(jié)果表明，納米銀顆?？赡苤苯悠茐腜IV3的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

圖2 不同組神經(jīng)氨酸酶活性的抑制率Fig 2 The inhibition rate of neuraminidase activity in different groups

圖3 3型副流感病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)(透射電鏡負(fù)染×200 000)Fig 3 Transmission electron microscope negative staining of parainfluenza virus 3(PIV3)

2.6 納米銀小鼠感染PIV3后的治療結(jié)果

2.6.1 一般生理狀況 正常對照組ICR小鼠毛發(fā)光滑，活動敏捷，飲食、飲水正常，體質(zhì)量持續(xù)增加;病毒對照組滴病毒后3 d，活動減少，毛色不光澤，開始出現(xiàn)戰(zhàn)栗，飲食和飲水減少，體質(zhì)量減輕。病毒對照組體質(zhì)量與納米銀治療組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6.2 肺指數(shù) 肺指數(shù)用來表示肺病變的嚴(yán)重程度。PIV3感染小鼠后引起肺部炎性細(xì)胞浸潤、水腫、充血，導(dǎo)致肺重量增加，肺指數(shù)增大。病毒對照組小鼠肺指數(shù)高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;肉眼觀，肺組織部分充血，水腫，顏色暗紅。納米銀治療組的小鼠肺組織與正常對照組比較接近，顏色呈粉紅，無差異。

2.6.3 肺組織病理變化 無菌剖取小鼠肺組織，可見正常對照組和納米銀對照組小鼠肺呈粉紅色，體積較小;病毒對照組小鼠肺充血水腫，顏色部分暗紅，體積增大;納米銀治療組小鼠肺體積大小與正常小鼠相近，但部分部位有充血現(xiàn)象。光鏡下結(jié)果顯示(圖4)，正常對照組和納米銀對照組小鼠肺組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肺泡大小均一，肺泡壁厚度正常，外周未見有炎性細(xì)胞浸潤;病毒對照組小鼠肺組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)消失，肺泡壁增厚，組織間可見大量紅細(xì)胞，肺泡腔有炎性細(xì)胞浸潤;納米銀治療組小鼠肺組織的病變明顯減輕，肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較為完整，肺泡腔中炎性細(xì)胞浸潤較少。

圖4 各組小鼠肺組織病理形態(tài)(HE染色×200)Fig 4 Pathological images of lung tissues in different mouse groups

3 討論

副流感病毒包膜表面突出有2種重要的糖蛋白:HN糖蛋白和F糖蛋白。HN糖蛋白通過與宿主細(xì)胞膜上的唾液酸受體結(jié)合，主要協(xié)助病毒表面蛋白和宿主細(xì)胞包膜之間的相互融合，促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞，與病毒的裝配釋放有關(guān)［10］。F糖蛋白具有使細(xì)胞融合劑溶解紅細(xì)胞的作用［1］，是病毒與宿主細(xì)胞融合所必需的，能夠促進(jìn)病毒核衣殼進(jìn)入并感染宿主細(xì)胞。銀有很強的殺菌能力，在古代人們就認(rèn)識到銀制品具有抗菌防腐作用，并將其用于實際生活中。納米銀在較低濃度下可對細(xì)菌和真菌產(chǎn)生抑制作用［2］，主要通過與菌體中酶蛋白的巰基(-SH)相結(jié)合，使酶失活，導(dǎo)致病原菌不能代謝而死亡［11］。此外，納米銀易通過化學(xué)鍵與外來原子結(jié)合，具備吸附病毒的能力［12］。

本實驗探討了納米銀對PIV3的抑制作用及其機(jī)制。MTT結(jié)果顯示，3種不同給藥方式下的納米銀處理組與PIV3對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);熒光實驗結(jié)果顯示，病毒對照組細(xì)胞內(nèi)部的免疫熒光強度明顯強于各實驗組，說明納米銀在體外對PIV3有抑制作用，其作用機(jī)制可能是納米銀與細(xì)胞表面受體結(jié)合，改變膜表面蛋白的構(gòu)象，導(dǎo)致對PIV3敏感的細(xì)胞變?yōu)椴幻舾械募?xì)胞;或者封閉細(xì)胞和病毒膜上的受體，阻止病毒的吸附，使其不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。納米銀作用組的神經(jīng)氨酸酶活性明顯降低(抑制率高于80%)，說明納米銀破壞或抑制了PIV3膜上的血凝素——神經(jīng)氨酸酶蛋白，即破壞或抑制了神經(jīng)氨酸酶的生物活性。透射電鏡顯示，與PIV3形態(tài)相比，納米銀與病毒作用30，60，120 min后，對病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞作用隨著時間的延長而增加，說明納米銀能直接破壞PIV3的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可能影響某些相關(guān)蛋白的表達(dá)和遺傳物質(zhì)的復(fù)制。

動物實驗結(jié)果顯示，納米銀治療組、陽性對照組和正常對照組3組小鼠生理狀態(tài)沒有差異，而病毒對照組小鼠出現(xiàn)飲食飲水下降，毛色變暗，沒有光澤;從病理切片上看，納米銀治療組小鼠的肺組織接近正常小鼠，而病毒對照組小鼠的肺組織有充血，水腫，炎性浸潤等明顯的病變。在PIV3感染的ICR小鼠動物模型中，病毒對照組小鼠體質(zhì)量3～5 d出現(xiàn)一過性降低，之后回升。5 d后解剖小鼠，比較小鼠生理狀態(tài)、肺組織切片等指標(biāo)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，但小鼠體質(zhì)量、死亡率、肺指數(shù)等指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義;結(jié)果表明，納米銀對小鼠PIV3有一定的治療作用。小鼠體質(zhì)量、死亡率、肺指數(shù)等指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義的原因可能因為ICR小鼠對PIV3產(chǎn)生了免疫作用，從而掩蓋了納米銀的部分治療作用。進(jìn)一步實驗應(yīng)該選擇和建立更敏感的動物模型，或縮短動物感染后檢測時間，檢測鼠肺中病毒滴度及動物發(fā)病率和死亡率。

納米銀對小鼠毒理安全性的研究本實驗室已報道，證實其低毒性對黏膜和皮膚無刺激性［13］。有研究［14］顯示，連續(xù)吸入60 nm的納米銀顆粒28 d，其呼吸系統(tǒng)和血液生化指標(biāo)沒有顯著變化。Stebounova等［15］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠暴露在納米銀的環(huán)境中(3.3 mg/m3)連續(xù)吸入40 h，誘導(dǎo)的肺部毒性和炎癥反應(yīng)非常低;與暴露在新鮮空氣環(huán)境中的小鼠比較，其肺功能、死亡率、臨床觀察、食物攝入量、體質(zhì)量等指標(biāo)沒有明顯差異［16］。納米銀的低毒性、無耐藥性以及廣譜抗病毒和抗菌特性，在呼吸道病毒感染的預(yù)防和治療中具有獨特的價值，值得深入研究。本研究中納米銀確切的抗PIV3機(jī)制還需作進(jìn)一步探討，如通過反轉(zhuǎn)錄PCR、實時定量PCR等技術(shù)可探討納米銀對PIV3核酸的影響作用;通過蛋白印跡技術(shù)可探討納米銀對宿主細(xì)胞信號通路傳導(dǎo)的影響，解釋納米銀間接抗病毒的作用和機(jī)制。

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