李慧昕，劉勝旺，韓宗璽，邵昱昊，劉曉麗，華育平，劉 娣，孔憲剛

（1.東北林業(yè)大學(xué)博士后流動(dòng)站 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后工作站，黑龍江 哈爾濱150086；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 禽傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱150001）

鴨病毒性腸炎（Duck viral enteritis，DVE），是由鴨腸炎病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的鴨、鵝及多種雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病［1］。其特征是流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率高［2］。1923年該病由Baudet 首次在荷蘭報(bào)道，我國(guó)于1957年首次暴發(fā)鴨病毒性腸炎［3］，隨后該病在華南、華中和華東等養(yǎng)鴨較發(fā)達(dá)的地區(qū)發(fā)生流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［4］。水禽和候鳥(niǎo)是本病病原的儲(chǔ)存宿主，且?guī)Ф鹃L(zhǎng)達(dá)4年之久［5］，為本病的有效防控帶來(lái)困難。

第9次國(guó)際病毒分類報(bào)告將DEV歸類為皰疹病毒科、α－皰疹病毒亞科、馬立克病毒屬成員。DEV具有皰疹病毒典型結(jié)構(gòu)特征，病毒DNA核心外依次包被著衣殼、皮層和囊膜［6－7］。病毒衣殼至少由7個(gè)蛋白組成，包括 VP5（UL19）、VP19C（UL38）、P21前體（UL26）、p22a（UL26.5）、VP23（UL18）、VP24（UL26）和VP26（UL35），其中 VP5為病毒的主要衣殼蛋白，占病毒衣殼總成分的60%～70%［8］。在單純皰疹病毒（HSV－1）和水痘帶狀皰疹病毒（VZV）感染宿主后，VP5是引起機(jī)體產(chǎn)生體液免疫的主要抗原之一［9－11］。在皰疹病毒中VP5同源蛋白較為保守且功能相近［12－13］，因此推測(cè)，DEV VP5在病毒感染過(guò)程中發(fā)揮相似的作用。

DEV基因組解析相較其他皰疹病毒滯后，DEV VP5在病毒復(fù)制過(guò)程中的功能尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究制備DEV VP5蛋白的單克隆抗體，為VP5蛋白的抗原表位研究及其在病毒復(fù)制過(guò)程中的功能研究提供了有效工具，同時(shí)為建立鴨病毒性腸炎檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒與細(xì)胞 鴨腸炎病毒DEV Clone－03株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽傳染病研究室保存，SP2/0細(xì)胞由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所禽傳染病研究室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 6～8周齡雌性BABL/c小鼠由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。HAT、HT、聚乙二醇（PEG1500），購(gòu)自 Gibco公司；羊抗鼠HRP－IgG，購(gòu)自Sigma公司；IgG抗體亞類試劑盒為Southern Biotech公司產(chǎn)品；免疫用抗原VP5－C蛋白由本研究室表達(dá)及純化。

1.3 動(dòng)物免疫 以本研究室制備的DEV Clone－03 VP5－C蛋白作為抗原，免疫8周齡雌性BABL/c小鼠。首次免疫，抗原與等體積SEPPIC IMS1312佐劑乳化，腹部皮下及背部皮下多點(diǎn)注射，50μg/只鼠。每隔兩周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，共計(jì)免疫3次，劑量及免疫途徑同首免。三免后2周，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，采取腹腔及尾靜脈注射50μg VP5－C抗原，于末次免疫后3d無(wú)菌取出脾細(xì)胞與SP2/0進(jìn)行融合。

1.4 細(xì)胞融合 按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，取免疫鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按細(xì)胞數(shù)量4∶1混合，以50%PEG為融合劑，將融合的細(xì)胞鋪到已加有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，100μL/孔，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后的細(xì)胞每3天更換培養(yǎng)基1次，使用含有HAT或HT培養(yǎng)基作為篩選培養(yǎng)液。待雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)至孔底部的1/3～1/2時(shí)，于換液后3～4d取細(xì)胞培養(yǎng)上清100μL，用建立的ELISA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，以免疫小鼠血清為陽(yáng)性對(duì)照、未免疫小鼠血清及SP2/0上清為陰性對(duì)照。將ELISA檢測(cè)陽(yáng)性孔的細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，采用有限稀釋法進(jìn)行。亞克隆3～4次，直至所有克隆化細(xì)胞孔檢測(cè)陽(yáng)性率為100%。

1.5 單克隆抗體腹水的制備 給經(jīng)產(chǎn)BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟，0.5mL/只。1周后，腹腔注射雜交瘤細(xì)胞懸液（1～2×106個(gè)/mL），0.5mL/小鼠。待小鼠腹部明顯膨大，行動(dòng)不便時(shí)，無(wú)菌取腹水，三氯甲烷處理去脂，分裝，－70℃保存。

1.6 單克隆抗體特性的鑒定

1.6.1 染色體計(jì)數(shù) 按常規(guī)方法進(jìn)行，選取SP2/0細(xì)胞及雜交瘤細(xì)胞，在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，向細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加入秋水仙素，使其終濃度為0.1μg/mL，37℃，5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)5h，1 000r/min離心5 min，收集細(xì)胞，加入5mL 0.075mol/L KCl進(jìn)行低滲處理，37℃溫育30min。向細(xì)胞懸液中加入固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）1mL，混勻，1 000r/min離心5min。棄上清，加入固定液5mL，將細(xì)胞懸浮，室溫靜置30min，1 000r/min離心5min；重復(fù)操作1次。加入固定液5mL，懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液滴在預(yù)先冰凍的載玻片上，自然擴(kuò)散，自然干燥。姬姆薩染色液染色，室溫30min，洗掉染色液，自然干燥，顯微鏡下選擇10個(gè)細(xì)胞形態(tài)完整、單在、染色體分散良好、無(wú)重疊、無(wú)散失的細(xì)胞進(jìn)行觀察及染色體計(jì)數(shù)分析，求出平均染色體數(shù)目。

1.6.2 抗體亞類的測(cè)定 采用SBAClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類試劑盒測(cè)定，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.6.3 抗體特異性鑒定 將超速離心的DEV clone－03全病毒行SDS－PAGE，將蛋白轉(zhuǎn)印至 NC膜，Western blot檢測(cè)分泌抗體陽(yáng)性的細(xì)胞株培養(yǎng)上清。用雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清作一抗，羊抗鼠HRP－IgG作為二抗，DAB顯色液顯色。

同時(shí)采用間接免疫熒光方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞分泌上清與病毒感染細(xì)胞的特異性反應(yīng)。將DEV clone－03接種生長(zhǎng)良好的CEF單層，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到60%～70%時(shí)，棄掉上清，細(xì)胞用PBS輕洗3次，加入少量胰酶消化細(xì)胞，用PBS將細(xì)胞吹下，1 000 r/min離心10min，PBS洗滌1次，制片，自然干燥，冷丙酮4℃固定15min，自然干燥后用PBST洗滌3次，自然干燥。以雜交瘤細(xì)胞分泌的上清為一抗，以抗鼠FITC－IgG為二抗（1∶100稀釋），熒光顯微鏡觀察。同時(shí)設(shè)未感染CEF為對(duì)照。

1.6.4 腹水效價(jià)的測(cè)定 抗DEV VP5單克隆抗體腹水效價(jià)用ELISA方法測(cè)定。將所獲得的腹水作1∶1×103、1∶2×103、1∶4×103、倍比稀釋至1∶4 096×103，共計(jì)12個(gè)稀釋倍數(shù)。用已經(jīng)建立的最佳蛋白（VP5－C）包被濃度包被ELISA板，檢測(cè)腹水效價(jià)。以陽(yáng)性血清、腹水稀釋液、陰性血清和SP2/0細(xì)胞的腹水作對(duì)照。具體判定標(biāo)準(zhǔn)為：陰性血清OD值＜0.2，陽(yáng)性血清OD值＞1.0，檢測(cè)樣品OD值＞0.2，P/N＞2.1時(shí)腹水的最大稀釋倍數(shù)為腹水的ELISA效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞株的建立 融合細(xì)胞經(jīng)HAT篩選，于融合后3～5d顯微鏡觀察，計(jì)數(shù)出現(xiàn)明顯細(xì)胞克隆的培養(yǎng)孔，其融合率為84.35%。應(yīng)用VP5－C蛋白包被ELISA板，用已建立的間接ELISA方法檢測(cè)上清，共計(jì)獲得4株單克隆抗體。將ELISA和Western blot檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行克隆，經(jīng)過(guò)3次克隆，所有細(xì)胞集落克隆孔檢測(cè)為均為陽(yáng)性，表明獲得了穩(wěn)定分泌的單克隆抗體，將獲得的4株單克隆抗體命名為1B5、3A1、4F9、6F6。

2.2 單克隆抗體特性鑒定

2.2.1 腹水效價(jià)的測(cè)定 將雜交瘤細(xì)胞株注射BALB/c小鼠，制備腹水，用已建立的檢測(cè)方法測(cè)定腹水的ELISA效價(jià)。單克隆抗體1B5、3A1、4F9、6F6腹水ELISA效價(jià)分別為1∶2 048×103、1∶512×103、1∶1 024×103、1∶512×103。

2.2.2 雜交瘤細(xì)胞染色體分析 隨機(jī)選擇細(xì)胞形態(tài)完整、染色體分散均勻的10個(gè)視野的染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算平均數(shù)，得到各雜交瘤細(xì)胞染色體平均數(shù)。本研究獲得的雜交瘤細(xì)胞株染色體數(shù)目為95～102，均高于小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)目（2n＝40）和SP2/0細(xì)胞染色體數(shù)目（2n＝62～68），融合后的雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目接近兩種親本之和，表明獲得的分泌抗體的細(xì)胞株為小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合后的雜交瘤細(xì)胞（圖1）。

圖1 雜交瘤細(xì)胞株的染色體分析A～D分別為雜交瘤細(xì)胞株1B5、3A1、4F9、6F6；E為骨髓瘤細(xì)胞SP2/0

2.2.3 單克隆抗體亞類鑒定 采用SBAClonotypingTMSystem/HRP抗體亞類試劑盒檢測(cè)，應(yīng)用分泌抗體陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞上清檢測(cè)單克隆抗體亞類。結(jié)果表明，獲得的4株單克隆抗體均為IgG、k鏈抗體。

2.2.4 單克隆抗體特異性鑒定 為了檢測(cè)所獲得的單克隆抗體是否特異地針對(duì)DEV clone－03VP5蛋白，我們采用Western blot方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞分泌上清對(duì)全病毒的反應(yīng)原性，結(jié)果表明，獲得的單克隆抗體能夠特異識(shí)別DEV clone－03VP5蛋白，大小約為150kDa（圖2）。

應(yīng)用間接免疫熒光方法，應(yīng)用雜交瘤細(xì)胞分泌上清檢測(cè)DEV clone－03，結(jié)果表明，單克隆抗體能夠與DEV clone－03發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，能夠識(shí)別天然構(gòu)象的 DEV clone－03VP5蛋白（圖3）。

3 討論

鴨病毒性腸炎傳播迅速，死亡率較高，盡管現(xiàn)有疫苗保護(hù)效果較好，但是水禽和候鳥(niǎo)帶毒為本病的清除帶來(lái)困難。因此，建立有效的鴨病毒性腸炎檢測(cè)方法將對(duì)該病的防控提供有效手段。免疫學(xué)診斷方法以其特有的優(yōu)勢(shì)成為實(shí)踐中檢測(cè)病原體的常用方法，特異性和準(zhǔn)確性直接取決于診斷試劑。而單抗隆抗體純度高、專一性強(qiáng)、重復(fù)性好且能在動(dòng)物體外或體內(nèi)產(chǎn)生同質(zhì)性抗體，以它作為診斷抗體能克服多克隆抗血清診斷時(shí)穩(wěn)定性差及特異性低等缺點(diǎn)。

皰疹病毒VP5是較大的病毒衣殼蛋白，其內(nèi)含有多處保守結(jié)構(gòu)域［14］。DEV VP5基因由4 143核苷酸組成，編碼約150kDa蛋白，與HSV－1VP5蛋白大小相似。由于VP5較大，原核表達(dá)全長(zhǎng)較為困難，因此本研究組對(duì)VP5蛋白進(jìn)行截短表達(dá)，并以純化的DEV VP5－C蛋白作為免疫原，制備單克隆抗體，共獲得了4株能夠穩(wěn)定分泌抗DEV VP5特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。在篩選抗體分泌陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞時(shí)，應(yīng)用純化的VP5－C蛋白包被ELISA板，進(jìn)行ELISA篩選，同時(shí)為了排除非特異性雜交瘤細(xì)胞的干擾，將ELISA篩選陽(yáng)性細(xì)胞株分泌上清用Western blot方法進(jìn)行檢測(cè)，以DEV全病毒作為抗原，檢測(cè)抗體的特異性。本研究對(duì)單克隆抗體進(jìn)行了3次克隆篩選，每次篩選都采用ELISA和Western blot兩種方法進(jìn)行檢測(cè)，確保單克隆抗體的特異性。

本研究對(duì)獲得的4株單克隆抗體進(jìn)行中和活性檢測(cè)，結(jié)果表明，4株單克隆抗體均不具有中和活性，這可能與衣殼蛋白外包被有囊膜有關(guān)，同時(shí)也與單克隆抗體所針對(duì)的抗原表位在衣殼蛋白中所處位置有關(guān)［15］。HSV－1VP5蛋白具有3個(gè)功能域，分別為底部、中部和上部功能域［16］，通過(guò)比對(duì)DEV VP5與HSV－1VP5蛋白，發(fā)現(xiàn)DEV VP5也具有這3個(gè)功能域，但是獲得的4株單克隆抗體識(shí)別功能域的位置還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。單克隆抗體的獲得為進(jìn)一步研究VP5功能，并確定VP5的B細(xì)胞抗原表位提供有效的工具，同時(shí)也為下一步探索開(kāi)發(fā)有效的診斷方法提供基礎(chǔ)。

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