劉安石，鐘蘭蘭，楊 亞，劉進(jìn)輝

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128）

草分枝桿菌屬分枝桿菌類的一種非病源性細(xì)菌，是抗酸分枝桿菌中的一種。草分枝桿菌對(duì)動(dòng)物機(jī)體的體液免疫作用，主要是通過(guò)增強(qiáng)Th細(xì)胞活性，促使Th細(xì)胞分泌B細(xì)胞生長(zhǎng)因子（BCGF）以及B細(xì)胞分化因子（BCDF），從而刺激B細(xì)胞進(jìn)入增殖、分化階段，最終促進(jìn)特異性抗體形成［1］。

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS），是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的以母豬妊娠后期發(fā)生流產(chǎn)、死產(chǎn)和木乃伊胎，新生仔豬死亡率高，各年齡豬（尤其是仔豬）出現(xiàn)異常呼吸為特征的傳染性繁殖障礙疾病。臨床癥狀主要表現(xiàn)為母豬發(fā)熱、厭食、流產(chǎn)或死胎、木乃伊胎，仔豬常出現(xiàn)呼吸道系統(tǒng)癥狀和高死亡率［2－4］。由于PRRSV 的基因型與血清型眾多，毒株間交互免疫力差［5－7］。且豬繁殖與呼吸綜合征在流行病學(xué)上出現(xiàn)了一些新的特點(diǎn)，危害程度仍呈上升趨勢(shì)，已成為規(guī)模化豬場(chǎng)繁殖障礙的主要疫病之一，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，對(duì)該病尚無(wú)特效的治療方法，疫苗免疫仍是其主要防控手段。但鑒于目前市場(chǎng)上豬繁殖與呼吸綜合征疫苗種類較多且質(zhì)量良莠不齊，豬場(chǎng)疫情錯(cuò)綜復(fù)雜，以及豬群存在嚴(yán)重的免疫抑制等因素，從而使得豬繁殖與呼吸綜合征的免疫效果差異性很大，且常常出現(xiàn)嚴(yán)重的免疫應(yīng)激和免疫失敗。因此，探索解決豬繁殖與呼吸綜合征疫苗的免疫問(wèn)題具有十分重要的臨床意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物與疫苗 草分枝桿菌（滅活粉劑）：500g/包，湖南某公司生產(chǎn)。

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗：JXA1－R株，每頭份病毒含量≥105.0TCID50，某疫苗生產(chǎn)廠家生產(chǎn)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 豬繁殖與呼吸綜合征ELISA抗體檢測(cè)試劑盒：武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

酶標(biāo)儀：9602G，北京艾普生物設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

數(shù)控?fù)u床振蕩器：DSR－10，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 從湖南某豬場(chǎng)通過(guò)IDEXX的ELISA和PCR/RT－PCR兩種方法進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)未感染PRRSV的20頭30日齡的健康斷奶仔豬。

試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)分組與設(shè)計(jì) 將20頭試驗(yàn)仔豬隨機(jī)分為4組，1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組，試驗(yàn)組分別為試驗(yàn)組Ⅰ、試驗(yàn)組Ⅱ和試驗(yàn)組Ⅲ，每組5頭。對(duì)照組正常飼喂，3個(gè)試驗(yàn)組分別于飼料中添加0.1%、0.2%和0.5%草分枝桿菌，連續(xù)喂料1周后，4個(gè)組均肌肉接種豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗1頭份，3個(gè)試驗(yàn)組在疫苗免疫后7d內(nèi)繼續(xù)飼喂拌有草分枝桿菌的飼料。免疫的前1天和免疫后的第14、21、28天和第35天測(cè)其抗體。

1.2.2 動(dòng)物免疫接種 在試驗(yàn)仔豬耳后頸部外側(cè)肌肉注射高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，免疫劑量為1mL/頭。

1.2.3 血清抗體檢測(cè) 免疫的前1天和免疫后的第14、21、28天和第35天，對(duì)所有試驗(yàn)仔豬進(jìn)行前腔靜脈采血5mL，置于離心機(jī)中以1 500r/min離心5min，取血清，冷藏保存?zhèn)溆?。將分離的血清用豬繁殖與呼吸綜合征ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗體的OD630nm值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 將試驗(yàn)數(shù)據(jù)詳細(xì)的記錄整理，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

各組試驗(yàn)仔豬的血清抗體OD630nm值檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，試驗(yàn)豬只在免疫前都具有一定量的母源抗體，但OD630nm值很低，起不到任何保護(hù)作用，所以此時(shí)注射豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗具有重要意義。

表1 各組試驗(yàn)仔豬的血清抗體OD630nm值檢測(cè)

從免疫后的第14天、第21天所測(cè)得的抗體OD630nm值來(lái)看，試驗(yàn)組和對(duì)照組豬只的抗體水平在逐步上升，但所有試驗(yàn)豬只的OD630nm值都小于0.38，表明還沒(méi)有產(chǎn)生具有保護(hù)作用的抗體。但從表1中數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，免疫后的14d內(nèi)3個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的OD630nm值沒(méi)有明顯的差別（P＞0.05）。免疫后的第21天，試驗(yàn)組Ⅱ、試驗(yàn)組Ⅲ相對(duì)于試驗(yàn)組Ⅰ和對(duì)照組其OD630nm值具有顯著差異（P＜0.05）；但試驗(yàn)組Ⅱ、試驗(yàn)組Ⅲ相比之間，試驗(yàn)組Ⅰ和對(duì)照組之間差異不顯著（P＞0.05）。試驗(yàn)結(jié)果表明，在仔豬飼料中添加0.2%以上的草分枝桿菌在豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫后的第21天可以起到明顯的提高抗體OD630nm值的作用。

從本次試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，對(duì)照組豬只在豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫后的第28天，產(chǎn)生有效保護(hù)抗體的仔豬比率為40%左右，免疫后35d，產(chǎn)生有效保護(hù)抗體的仔豬比率為60%，其他的40%為可疑。而第28天3個(gè)試驗(yàn)組的抗體OD630nm值，試驗(yàn)組Ⅰ陽(yáng)性60%，陰性40%；試驗(yàn)組Ⅱ陽(yáng)性80%，可疑20%；試驗(yàn)組Ⅲ陽(yáng)性80%，陰性20%。35d的抗體OD630nm值，試驗(yàn)組Ⅰ陽(yáng)性80%，可疑20%；試驗(yàn)組Ⅱ和試驗(yàn)組Ⅲ的陽(yáng)性均為100%。試驗(yàn)結(jié)果表明，在仔豬免疫的前后21d于飼料中添加草分枝桿菌均可有效的提高豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的抗體效價(jià)，與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01），添加0.2%和0.5%草分枝桿菌比添加0.1%的草分枝桿菌效果更好，且差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

滅活的草分枝桿菌主要通過(guò)影響免疫應(yīng)答反應(yīng)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。草分枝桿菌可以增強(qiáng)Th細(xì)胞活性，促使Th細(xì)胞分泌B細(xì)胞生長(zhǎng)因子（BCGF）以及B細(xì)胞分化因子（BCDF），從而刺激B細(xì)胞進(jìn)入增殖、分化階段，最終促進(jìn)特異性抗體形成。臨床藥理作用表明，使用本品后血清IgG，IgM滴度增高。持久的介入機(jī)體的免疫過(guò)程，不斷的調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫及體液免疫系統(tǒng)［8］。草分枝桿菌能顯著增強(qiáng)特異性細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖，促進(jìn)白細(xì)胞介素2（IL－2）、白細(xì)胞介素4（IL－4）、腫瘤壞死因子（TNF）、γ－干擾素（IFN－γ）等各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生還可顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞活性。臨床藥理試驗(yàn)證明，用藥后 T3，T4，T8，T4/T8均有明顯增加。草分枝桿菌對(duì)巨噬細(xì)胞的作用也十分明顯，主要表現(xiàn)為草分枝桿菌能刺激T淋巴細(xì)胞，使之釋放巨噬細(xì)胞凝集因子（MAF）、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（MIF）、巨噬細(xì)胞趨化因子（MCF）、促有絲分裂因子（MMF）等，對(duì)單核－巨噬細(xì)胞功能和代謝等各方面都有促進(jìn)作用，還可以促進(jìn)單核－巨噬細(xì)胞釋放大量O2－，這與殺滅病原體及腫瘤細(xì)胞有關(guān)。草分枝桿菌尚可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和單核－巨噬細(xì)胞產(chǎn)生CSF，促進(jìn)骨髓多能干細(xì)胞和脾粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的前體增殖。從表1可以看出，隨著草分枝桿菌在仔豬飼料中添加量的增加，豬群的抗體OD630nm也隨之增加。這說(shuō)明給仔豬喂食拌有草分枝桿菌的飼料后，豬體內(nèi)的抗體水平有明顯升高。通過(guò)本次試驗(yàn)可以看出，在豬飼料中添加0.2%以上的草分枝桿菌能夠提高豬藍(lán)耳病疫苗免疫的抗體水平，以提高其免疫效果。

［1］ 鐘小婭，黃定蒙.草分枝桿菌對(duì)尖銳濕疣患者Th1/Th2免疫平衡的調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)藥師雜志，2006，13（4）：19－21.

［2］ 黃驪，郭萬(wàn)柱.豬生殖與呼吸綜合征綜述［J］.四川畜牧獸醫(yī)，1999，3：17－18.

［3］ 孫世琪，靳野，郭慧琛，等.我國(guó)近期高致病性藍(lán)耳病分子流行病學(xué)動(dòng)態(tài)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25（7）：69－71.

［4］ 王珍芹，曲志娜.豬繁殖與呼吸綜合征免疫預(yù)防進(jìn)展［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2005，22（12）：37.

［5］ 徐引弟，宋念華，張厚芝，等.豬生殖和呼吸系統(tǒng)綜合征的血清學(xué)調(diào)查［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，2003，33（1）：25－27.

［6］ 楊小燕，李曉華，沈紹新，等.豬繁殖與呼吸綜合征的血清學(xué)調(diào)查［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2001，37（4）17－22.

［7］ 王君瑋，徐天剛，吳延功，等.山東部分地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征的血清流行病學(xué)調(diào)查［J］.畜牧與獸醫(yī)，2004，3（6）：32－35.

［8］ 程相鐸，雍磊，梅海豫.草分枝桿菌注射液輔助治療支氣管哮喘［J］.實(shí)用醫(yī)藥雜志，2009，26（2）：132－135.