王 璞，盛巧玲，李 鑫，孟祥莉，張文龍，王君偉

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（C.perfringenstypeA）可以感染包括牛在內(nèi)的多種動物，導(dǎo)致腸毒血癥、壞死性腸炎、創(chuàng)傷性氣性壞疽、猝死癥等，其特點(diǎn)為發(fā)病急、病程短、致死率高，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［1］。因此，產(chǎn)氣莢膜梭菌病發(fā)病機(jī)制及防治技術(shù)的研究亟待深入。一種良好的動物模型是研究疫病發(fā)病機(jī)制及防治技術(shù)的必備條件之一，國內(nèi)外均有利用小鼠建立產(chǎn)氣莢膜梭菌感染動物模型的報道［2］。然而國內(nèi)相關(guān)研究更多關(guān)注小鼠的死亡率，而對其組織病理變化報道很少［3］，本試驗(yàn)以牛源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C987株為基礎(chǔ)，摸索不同細(xì)菌接種途徑，建立了產(chǎn)氣莢膜梭菌小鼠感染模型，并對小鼠器官病變及組織學(xué)變化進(jìn)行觀察，為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌病防治技術(shù)開發(fā)及致病機(jī)制研究提供了一種合適的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C987株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；清潔級昆明系小鼠，購自哈爾濱市腫瘤醫(yī)院；無菌綿羊血，購自賽拓科技有限公司；日本三菱瓦斯厭氧產(chǎn)氣袋，購自北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；肉肝湯培養(yǎng)基，購自上海江萊科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C987株劃線于5%綿羊血平板上，37℃厭氧培養(yǎng)14h。觀察菌落形態(tài)，挑取單個菌落接種于10mL肉肝胃酶消化湯中，培養(yǎng)基上方加入1mL滅菌石蠟，靜置培養(yǎng)24h。涂片革蘭染色，觀察菌體形態(tài)。

1.2.2 細(xì)菌生長曲線的繪制 挑取單菌落，接種于10mL肉肝胃酶消化湯中，靜置培養(yǎng)10h。培養(yǎng)物按5%接種到120mL肉肝胃酶消化湯中，每2小時測定菌液OD600值，連續(xù)監(jiān)測24h。前6h取100μL菌液進(jìn)行10－4倍稀釋，6h后取100μL菌液進(jìn)行10－6倍稀釋，稀釋后菌液取100μL涂布于5%綿羊血平板上，每個稀釋度涂布3個平板。平板于37℃厭氧培養(yǎng)14h，進(jìn)行菌落計數(shù)，繪制細(xì)菌生長曲線。

1.2.3 動物試驗(yàn) 15～20g昆明系小鼠55只，隨機(jī)分為11組，每組5只。第1～6組用灌胃方式接種（灌胃前禁食1d，飲水正常），第7～11組用背部皮下多點(diǎn)注射方式接種。第1組灌胃肉肝胃酶消化湯1mL，作為灌胃接種試驗(yàn)陰性對照，第2～6組分別灌胃接種產(chǎn)氣莢膜梭菌濃度5.5×108CFU/mL、1.1×109CFU/mL、2.2×109CFU/mL、4.4×109CFU/mL、8.8×109CFU/mL菌液1mL。第7組背部皮下多點(diǎn)注射肉肝胃酶消化湯1mL，作為皮下注射接種試驗(yàn)陰性對照，第8～11組分別注射接種產(chǎn)氣莢膜梭菌濃度3×106CFU/mL、6×106CFU/mL、1.2×107CFU/mL、2.4×107CFU/mL菌液1 mL。每6小時觀察1次，連續(xù)觀察240h，記錄小鼠精神狀態(tài)、毛色、進(jìn)食、進(jìn)水情況、死亡數(shù)量及死亡時間。利用SPSS18.0軟件繪制小鼠生存曲線圖，用LD50數(shù)據(jù)處理程序1.01版本計算不同接種途徑，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌對小鼠半數(shù)致死量（LD50）。

1.2.4 小鼠病理變化觀察 240h內(nèi)死亡小鼠剖檢，觀察心、肝、脾、肺、腎等臟器病變情況并涂片鏡檢，每組隨機(jī)選取1只，采集其內(nèi)臟器官做石蠟切片，并進(jìn)行組織化學(xué)染色觀察。240h后將未死亡小鼠斷頸處死，取心、肝、脾、肺、腎等臟器涂片鏡檢。

2 結(jié)果

2.1 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C987株生長曲線的繪制C987株在6h達(dá)到對數(shù)生長期末期，此時OD600＝1.67，菌液濃度為5.5×108CFU/mL（見圖1）。

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌生長曲線

2.2 動物試驗(yàn) 小鼠接種產(chǎn)氣莢膜梭菌后，出現(xiàn)后肢麻木、精神極度委靡、皮毛凌亂、腹部膨大等癥狀，各組小鼠出現(xiàn)的癥狀及開始出現(xiàn)癥狀的時間（見表1）。第5、6、10、11組小鼠腹部膨大明顯，第2、3、8組小鼠腹部膨大不明顯。剖檢涂片顯示，第4、5、6、9、10、11組死亡小鼠心、肝、脾、肺、腎、腸有革蘭陽性大桿菌檢出；第2、3組死亡小鼠除腸道外，其他器官無細(xì)菌檢出。對照組小鼠無病理變化。

經(jīng)計算，A型產(chǎn)氣莢膜梭菌C987株灌胃途徑接種小鼠LD50為4.35×109CFU，背部皮下多點(diǎn)注射途徑接種小鼠LD50為8.01×106CFU。

2.3 小鼠組織病理觀察結(jié)果 死亡小鼠的腸道臌氣明顯并伴有出血，肝臟腫大、充血，表面不光滑，脾臟腫大、充血。

通過組織化學(xué)檢查表明，與對照組小鼠相比，試驗(yàn)組小鼠的肝臟中央靜脈充血、出血，肝細(xì)胞索狀排列結(jié)構(gòu)消失，組織間隙有大量炎性細(xì)胞浸潤，明顯可見胞內(nèi)出現(xiàn)核碎裂、溶解，肝臟細(xì)胞發(fā)生顆粒變性，同時可見肝細(xì)胞溶解；小腸上皮細(xì)胞脫落、壞死，腸絨毛結(jié)構(gòu)消失，組織間隙內(nèi)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞，同時可見明顯出血；肺泡上皮細(xì)胞增生，同時伴有變性和壞死，肺泡內(nèi)可見纖維樣滲出，肺泡組織間隙可見出血，同時有大量炎性細(xì)胞滲出；脾臟出血明顯；腎小球腫脹、淤血，腎小囊腔間隙變小，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生腫脹、變性、壞死，腎小管管腔變小，腎小管間隙出血明顯，同時伴有大量炎性細(xì)胞浸潤；心肌纖維碎裂，細(xì)胞核溶解，心肌纖維毛細(xì)血管淤血明顯，細(xì)胞間質(zhì)有出血，同時可見大量炎性細(xì)胞浸潤（見中插彩版圖2）。

表1 不同接種菌數(shù)小鼠出現(xiàn)臨床癥狀時間以及死亡數(shù)量

3 討論

使用動物模型是現(xiàn)代獸醫(yī)科學(xué)研究中極為重要的試驗(yàn)方法和手段，有助于更方便、更有效地認(rèn)識疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和研究防治措施。一種良好的動物感染模型能夠增加試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，簡化試驗(yàn)操作并且能夠較為完善地反映本動物自然發(fā)病過程中的大部分病理特征。

本試驗(yàn)嘗試采用灌胃和皮下注射兩種接種方式建立產(chǎn)氣莢膜梭菌小鼠感染模型。從產(chǎn)生的癥狀及病變情況來看，兩種接種方式差別不大。雖然通過灌胃接種，更接近產(chǎn)氣莢膜梭菌腸道感染的天然途徑［4］，但皮下注射接種方式所需細(xì)菌接種量遠(yuǎn)少于灌胃接種方式，而小鼠死亡率卻高于灌胃接種；另外，皮下注射接種細(xì)菌數(shù)量相對穩(wěn)定，小鼠死亡時間更加集中，試驗(yàn)平行性更佳，因此皮下多點(diǎn)注射接種途徑更適合用于建立產(chǎn)氣莢膜梭菌小鼠感染模型。

相關(guān)報道表明，牛感染產(chǎn)氣莢膜梭菌后腹部高度膨脹，心外膜及心內(nèi)膜有不同程度的出血點(diǎn)或出血斑［5］，脾腫脹、被膜下或邊緣部有出血點(diǎn)，腸管外觀呈暗紅色，腸黏膜嚴(yán)重出血［6］，腎臟腫大、被膜出血、實(shí)質(zhì)變軟，重者泥狀，肝臟腫大質(zhì)脆、色澤暗淡、有充血斑［5］。本試驗(yàn)中，接種小鼠內(nèi)臟病理變化及組織學(xué)變化與上述報道極為相似，說明建立的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌小鼠感染模型可以在很大程度上模擬牛感染A型產(chǎn)氣莢膜梭菌后內(nèi)臟的病理變化，因此該模型不僅可以用于各種A型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗的評價，同時可以用于A型產(chǎn)氣莢膜梭菌致病機(jī)制的研究。

［1］ 德艷艷，姜志剛，牛思博.攜帶非典型cpb2基因牛源A型產(chǎn)氣莢膜梭菌重組α毒素的免疫保護(hù)性研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2012，23（7）：563－567.

［2］ Kerry K，Cooper J.Glenn Songer.Virulence of Clostridium perfringens in an experimental model of poultry necrotic enteritis［J］.Veterinary Microbiology，2010，142：323－328.

［3］ 石玉玲，徐少珊，孫朝暉，等.小鼠氣性壞疽動物模型的建立［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2011，11（3）：299－303.

［4］ Fernandez－Miyakawa，Sameera Sayeed.Development and Application of an Oral Challenge Mouse Model for Studying Clostridium perfringens Type D Infection［J］.Infection and Immunity，2007，75（9）：4282－4288.

［5］ 鄭曉麗，竇賢明，胡道俊，等.產(chǎn)氣莢膜梭菌對養(yǎng)牛業(yè)的危害及其防制 ［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（8）：211－214.

［6］ 倪宏波.牛產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒血癥的診斷［J］.中國獸醫(yī)雜志，2006，42（6）：53－54.