盧 梅，孫 波，李 建，肖 榕，李 靖，鄭小波

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460）

原癌基因是細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，是維持機(jī)體正常生命活動所必須的，在進(jìn)化上高度保守。原癌基因是細(xì)胞的正常基因，其表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞的生理功能極其重要，當(dāng)原癌基因的結(jié)構(gòu)或調(diào)控區(qū)發(fā)生變異，基因產(chǎn)物增多或活性增強(qiáng)時，使細(xì)胞過度增殖，從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變形成腫瘤。原癌基因種類很多，涉及到細(xì)胞信號傳遞的各個層次［1］。C－Fos是一種原癌基因，屬于快速早期基因。其編碼的Fos蛋白是真核細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子，在信號傳導(dǎo)過程中起重要作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，C－Fos原癌基因及其蛋白不僅參與細(xì)胞的正常生長、分化過程，而且參與細(xì)胞內(nèi)信息傳遞過程和細(xì)胞的能量代謝過程，在生命活動中起著極為基本而重要的作用［2］。

近年來，國內(nèi)外對人、野豬、鼠等動物C－Fos基因及相關(guān)研究均有報(bào)道，并通過大量試驗(yàn)證明，在精子發(fā)生過程中，C－Fos在生殖細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)出階段性和特異性表達(dá)，在生精細(xì)胞發(fā)育過程中起著重要調(diào)控作用［3］。榮昌豬C－Fos的研究少，本試驗(yàn)對其進(jìn)行了克隆與序列分析，為進(jìn)一步研究榮昌豬C－Fos基因的結(jié)構(gòu)和功能提供理論依據(jù)，同時也為榮昌豬其他功能基因的研究提供可靠的分子內(nèi)標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料 本試驗(yàn)所需的睪丸由榮昌畜牧局養(yǎng)殖場提供。EASYspin Plus組織/細(xì)胞RNA試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、DL－2 000Marker、割膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、E.coliDH5α、pMD18－T載體連接試劑盒等，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上登錄的 野 豬 C－Fos序 列 （AJ132510.1），使 用 Primer Primer5軟件設(shè)計(jì)2對分段特異性引物P1、P2和P1′、P2′，這兩對引物擴(kuò)增的目的基因片段 C－Fos－1和C－Fos－2長度分別為827bp和718bp，引物序列如下：

① P1：5′－ATGATGTTCTCCGGCTTCAAC－3′

P2：5′－CTGGGAACAGGAAGTCATCAAA－3′

② P1′：5′－TCCGAAGGGAAAGGAATAAGAT－3′

P2′：5′－TTTTTTTCACAGGGCCAGC－3′

1.2.2 總RNA的提取 組織總RNA的抽提方法按試劑盒說明書操作。

1.2.3 cDNA的獲取及RT－PCR 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，以榮昌豬睪丸總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為第一鏈cDNA，利用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增榮昌豬的C－Fos原癌基因。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 純化回收、載體構(gòu)建及陽性克隆篩選 按DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、pMD18－T載體連接試劑盒及其說明書操作。最后以1%瓊脂糖凝膠電泳陽性鑒定。

1.2.5 序列測定及分析 將PCR檢測為陽性的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，保藏，并送TaKaRa公司測序，拼接。采用DNAman進(jìn)行序列分析后，使用 MEGA5.03軟件按NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap值設(shè)為1 000。

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取及鑒定 按照EASYspin Plus組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒說明書操作提取榮昌豬睪丸組織總RNA。得到OD260/OD180為2.1，且電泳可見清晰的28s和18s條帶，前者亮度約為后者兩倍，說明提取的RNA比較完整且降解較少，符合用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA要求。結(jié)果如圖1。

2.2 C－Fos的PCR擴(kuò)增 用特異性引物以榮昌豬的總RNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在750bp上下各擴(kuò)增出明顯的單一條帶，它與預(yù)期估計(jì)值827bp、718bp較為接近（圖2）。

2.3 PCR鑒定陽性克隆 將純化的C－Fos PCR產(chǎn)物與pMD18－T Vector連接，CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，LB/Amp固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12～14h，挑取單個菌落于LB/Amp液體培養(yǎng)基再培養(yǎng)6～7h，然后將菌液經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定陽性克隆，結(jié)果為陽性（圖3）。

2.4 C－Fos堿基測序及分析 將經(jīng)過PCR鑒定陽性的菌液送至TaKaRa公司進(jìn)行雙向測序，根據(jù)各序列的重疊區(qū)域進(jìn)行拼接，得出全長為1 143bp，最終得到榮昌豬C－Fos ORF序列并上傳至GenBank，獲得序列號JX861095。將榮昌豬C－Fos序列與野豬（AJ132510.1），馬 （XM _001491972.2），牛（AY322482.1），綿羊（NM_001166182.1），家貓（DQ288168.1），大熊貓（XM_002914704.1），人（NM_004469.4），黑猩猩（AB219119.1），獼猴（AB219121.1），大鼠（DQ089699.1），小鼠（NM_010234.2），家兔（XM_002714687.1），等 C－Fos用DNAman進(jìn)行核酸同源性比對，結(jié)果顯示，同源性分別為99.48%、95.20%、95.20%、94.14%、93.7%、94.14%、93.0%、93.10%、93.10%、88.58%、82.48%、88.58%。用MEGA 5.03按NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)C－Fos原癌基因表達(dá)有組織、細(xì)胞、階段的特異性。在胚胎早期僅在胚胎外組織如羊膜和胎盤中表達(dá)。胚胎后期則出現(xiàn)在發(fā)育中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胚胎骨、軟骨和牙齒生長區(qū)［4］。在成體器官中，C－Fos表達(dá)于巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞，另外還在生殖細(xì)胞中表達(dá)。但在其他大多數(shù)的細(xì)胞中，它的表達(dá)水平相對較低，需要通過刺激才能維持高表達(dá)［5，16］神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)家認(rèn)為，在神經(jīng)元產(chǎn)生動作電位的時候經(jīng)常表達(dá)［6］。C－Fos已經(jīng)被證明與許多物質(zhì)如酪蛋白激酶2［7］，α1、B細(xì)胞淋巴瘤蛋白3抗體［8］、DNA 損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子 3［9］、輔因子 BRCA1［10］、TATA 結(jié)合蛋白［11］、核受體輔活化因子1，2［12］、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1，2［13］、c－jun［14］和 SMAD3［15］等相關(guān)。目前國內(nèi)外對C－Fos的研究相對較少，對豬的研究更少。GenBank上登陸的C－Fos序列來自野豬，而榮昌豬作為中國四大地方豬種之一，卻缺乏此方面的研究。本試驗(yàn)根據(jù)GenBank上登錄的野豬CFos序列，用Primer Primer5軟件進(jìn)行分段設(shè)計(jì)引物。擴(kuò)增出特異性片段后，經(jīng)雙向測序，獲得兩段序列。根據(jù)各序列的重疊區(qū)域進(jìn)行拼接，得出全長為1 143bp，編碼381個氨基酸，其起始密碼子為ATG終止密碼子為TGA。

圖4 不同種C－Fos CDS序列構(gòu)建NJ法系統(tǒng)進(jìn)化樹

將榮昌豬C－Fos與野豬、馬、牛等進(jìn)行分析比對，發(fā)現(xiàn)在這些種系中的Fos蛋白序列統(tǒng)一性為69.40%，而且在這些種系中的Fos均存在一個由88個完全相同的氨基酸順序組成的區(qū)域。這個區(qū)域包括一個能與DNA結(jié)合的基本區(qū)和LZ結(jié)構(gòu)。榮昌豬C－Fos的CDS序列與其他動物的CDS進(jìn)行同源性分析比較，結(jié)果顯示，其進(jìn)化關(guān)系與基因水平一致，榮昌豬與野豬的同源性最高，與其他動物則較野豬的同源性相對較低。用 MEGA 5.03軟件按NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，C－Fos在種間、種內(nèi)的距離與寬度和重疊排列上都有所不同，相同的物種聚為一枝，且自展自持率均大于90%，大熊貓、貓、兔獨(dú)立成枝與榮昌豬的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。

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