吳 群，魏 泓，肖 榕，卿利娟，葛 亮，李 婧，商海濤，鄭小波，劉 宇

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌402460；2.中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)教研室，重慶 沙坪壩400038）

類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein，StAR），也稱類固醇激素靈敏調(diào)節(jié)蛋白，是促進(jìn)膽固醇由線粒體外膜轉(zhuǎn)入到線粒體內(nèi)膜的一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在膽固醇的代謝以及類固醇激素的合成中起關(guān)鍵的限速作用［1］。研究表明，StAR不僅存在于類固醇激素生成組織（腎上腺、睪丸、卵巢），而且表達(dá)于其他組織中，其中研究最多的是肝臟［2－3］。此外，StAR在調(diào)節(jié)睪酮的合成過程中起重要的作用，是維持正常生理功能所必須的一種重要蛋白［4］。最近的研究表明，StAR通過調(diào)節(jié)膽汁酸的合成，增加膽固醇的排泄，為脂肪肝等脂類代謝異常類疾病的防治提供了一條新的途徑［5］。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)StAR蛋白的研究主要集中在嚙齒動(dòng)物，關(guān)于豬StAR蛋白的調(diào)節(jié)功能及其機(jī)制的研究較少。

為此，本試驗(yàn)根據(jù)NCBI上發(fā)布的豬StAR基因cDNA序列（NM_213755.2），對(duì)巴馬香豬StAR基因進(jìn)行克隆，旨在構(gòu)建真核表達(dá)pEGFP－C1－StAR載體，為進(jìn)一步探討StAR基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性以及功能提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 豬睪丸組織 取自解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物教研室學(xué)校豬場(chǎng)，健康巴馬香豬睪丸組織。

1.2 菌株、質(zhì)粒和試劑 菌株E.coliDH5α、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等，購(gòu)自TaKaRa公司；RNA快速提取試劑盒，購(gòu)自北京艾德萊公司；pEGFP－C1載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)NCBI上發(fā)布的豬StAR基因cDNA序列，交由TaKaRa公司合成，下劃線為酶切位點(diǎn)，引物序列如下所示：

上 游 引 物：5′－GCTAGCTGCCTCCGCTACCAGGAAACA－3′，（含 NheI的酶切位點(diǎn)）；

下 游 引 物：5′－GAATTCGCTGAGCTTTAACACCTGGCTTC－3′，（含EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)）。

1.4 StAR基因全長(zhǎng)cDNA的獲得 用RNA提取試劑盒從睪丸組織中提取總RNA。RT－PCR擴(kuò)增總RNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得巴馬香豬的StAR基因?；厥漳康钠?。

1.5 StAR基因克隆載體的構(gòu)建 目的片段接連至pSURE－T克隆載體的反應(yīng)液于16℃連接過夜。轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)白色菌落。對(duì)菌液雙酶切初步鑒定后，挑選陽(yáng)性克隆菌液送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 pEGFP－C1－StAR真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將克隆陽(yáng)性質(zhì)粒和pEGFP－C1載體質(zhì)粒經(jīng)NheⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行大體系雙酶切?；厥漳康幕蛐蛄泻途€性化的載體序列，在T4連接酶作用于16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化后挑取陽(yáng)性菌落，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序，所得重組克隆載體命名為pEGFP－C1－StAR。

2 結(jié)果

2.1 StAR基因的RT－PCR擴(kuò)增 以巴馬香豬的總RNA為模板進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，在858bp處出現(xiàn)1條明顯的條帶，它與預(yù)期估計(jì)值較為接近（圖1－A）。

2.2 克隆質(zhì)粒pSURE－StAR質(zhì)粒PCR鑒定 將純化后的StAR的PCR產(chǎn)物與pSURE－T載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α受體菌，獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)目的片段（圖1－B）。

2.3 pEGFP－C1－StAR 重組質(zhì)粒的 PCR 檢測(cè)與酶切鑒定 以pEGFP－C1－StAR重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，觀察到1條長(zhǎng)度在750～1 000bp的特異性條帶（圖1－C）。pEGFP－C1－StAR 重組質(zhì)粒用NheⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切鑒定，可以看到目的條帶清晰且片段大小正確（圖1－D）。

圖1 StAR基因載體構(gòu)建與鑒定

2.4 測(cè)序結(jié)果 如下引物圖為巴馬香豬StAR基因序列。

2.5 StAR基因ORF序列同源性分析和堿基差異比較 對(duì)測(cè)序所得的StAR基因序列與GenBank中發(fā)表的3個(gè)StAR蛋白序列進(jìn)行同源性比較（圖2）和堿基差異比較（表1）。結(jié)果表明，巴馬香豬StAR基因ORF序列與其他參考序列的同源性高達(dá)99.3%～99.8%。

圖2 豬StAR基因ORF序列同源性分析

表1 豬StAR基因堿基差異比較

2.6 同源性進(jìn)化樹分析 利用DNA Star軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹（圖3），從進(jìn)化樹中可以看出巴馬香豬單獨(dú)成枝，不存在與其他豬種相互滲透，與其他枝葉的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。

3 討論

巴馬香豬是我國(guó)特有的小型豬品系資源，其在解剖結(jié)構(gòu)、生理代謝等方面與人體具備高度相似性，且豬遺傳修飾相對(duì)容易，建立豬的基因工程模型已成為當(dāng)今世界生物醫(yī)藥研究的熱潮。因此，巴馬香豬作為一種地方純種豬，將是研究疾病模型的重要選擇。

圖3 豬StAR cDNA序列的分子進(jìn)化樹

研究表明，許多疾病與StAR基因存在密切的關(guān)系。例如，先天性脂樣腎功能增生綜合征（CLAH）是StAR蛋白基因突變所引起的常染色體隱性遺傳性疾?。?］。此外，在多囊卵巢綜合征（PCOS）中，StAR 蛋白在內(nèi)膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中過度表達(dá)，造成顆粒細(xì)胞不成熟黃體化［7］。Ning等［5］的研究表明，StAR表達(dá)與年齡及血脂有一定的聯(lián)系，為進(jìn)一步探討脂質(zhì)代謝紊亂在動(dòng)脈粥樣硬化中的作用奠定了基礎(chǔ)。另外，StAR基因是類固醇激素合成的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，在睪丸激素調(diào)控方面起著重要的作用。

StAR在不同物種間一致性為85%～90%，相似性大于90%［8］。本試驗(yàn)從巴馬香豬擴(kuò)增得到了StAR基因ORF區(qū)序列，全長(zhǎng)858bp，編碼285個(gè)氨基酸，序列分析表明，擴(kuò)增的豬StAR基因ORF區(qū)序列與GenBank中3個(gè)豬StAR基因mRNA序列（登錄號(hào)為 AB530157.1、AY368628.1、AY800265.1）的同源性為99.3%～99.8%。StAR的氨基端（N′－端）由62個(gè)氨基酸組成的線粒體引導(dǎo)序列；羧基端（C′端）為生物活性部位，可與脂質(zhì)或膽固醇結(jié)合，大約由210個(gè)氨基酸組成，該結(jié)構(gòu)域稱為StAR相關(guān)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域（START）［9］。缺失 C－末端第28氨基酸會(huì)致使StAR失去活性［10］。經(jīng)文獻(xiàn)分析表明，構(gòu)建的StAR序列第26位氨基酸與其他豬種存在差異。

構(gòu)建真核表達(dá)載體是研究蛋白功能的一種重要工具。本試驗(yàn)成功擴(kuò)增和克隆了豬StAR基因，并構(gòu)建了豬StAR的真核表達(dá)載體pEGFP－C1－StAR，為下一步StAR基因在豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的特異性表達(dá)做準(zhǔn)備。

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