苗麗娟，張立春，唐艷林

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 吉林132101）

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）等相關(guān)疾病的主要病原。該病1991年在加拿大首次報(bào)道［2］，主要感染5～12周齡仔豬，致死率可達(dá)40%，PCV2在淋巴細(xì)胞增殖，可引起免疫細(xì)胞的凋亡，損傷豬體的免疫系統(tǒng)造成免疫抑制，易造成PPV、PRRS及其他疾病的繼發(fā)感染，給全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PCV2是圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬成員，為單股環(huán)狀負(fù)鏈無(wú)囊膜的DNA病毒，為已知的最小動(dòng)物病毒之一，約17～20nm，二十面體對(duì)稱(chēng)。根據(jù)病毒的抗原性和基因組成不同，可分為2種基因型或稱(chēng)血清型，即PCV1型和PCV2型。PCV1型無(wú)致病性；PCV2型具有致病性，基因組全長(zhǎng)1 767bp或1 768bp，包括11個(gè)讀碼框，其中ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白－核衣殼蛋白（Cap），決定著PCV2的表型特異性，現(xiàn)在的基因工程疫苗是疫苗研究的熱點(diǎn)，技術(shù)思路是通過(guò)分析病毒的基因序列來(lái)預(yù)測(cè)病原體的抗原信息，然后篩選出合適的候選抗原，進(jìn)而研制出有效的疫苗，本文的目的就是在已獲得的PCV－2基因組序列資料的基礎(chǔ)上，運(yùn)用計(jì)算機(jī)和分子生物學(xué)軟件對(duì)其結(jié)構(gòu)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而為PCV－2的反向疫苗學(xué)研究提供理論依據(jù)；為研制適合臨床應(yīng)用的ELISA診斷試劑盒和單克隆抗體的制備和抗原表位的鑒定工作奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 pcv－581重組質(zhì)粒的構(gòu)建

1.1.1 PCR擴(kuò)增去除 NLS基因的pcv－581

1.1.1.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室保存毒株的測(cè)序結(jié)果，用Oligo 6.0設(shè)計(jì)刪除核定位信號(hào)特異引物（由寶生物工程（大連）有限公司合成），并引入限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ（加下劃線表示）。上游引物：ACAGGATCCATGGCATCTTCAACAC；下游引物：GAAAGCTTTTCATTAAGGGTTAAGT；產(chǎn)物長(zhǎng)度581bp。

1.1.1.2 PCV2核酸的提取 取接種PCV2病毒的PK－15細(xì)胞懸液500μL，常規(guī)方法提取，最后加20μL滅菌去離子水溶解，－20℃保存。

1.1.1.3 PCR擴(kuò)增 PCR的反應(yīng)體系總體積25 μL：上、下游引物（10μmol/L）各1.0μL，10×RCR Buffer 2.5μL、dNTP 3.0μL（2.5mmol/L each），提取的 DNA 2.0μL，Taq酶0.25μL（5U/μL，TaKaRa），去離子水補(bǔ)到25μL。反應(yīng)參數(shù)為：95℃，5min；94℃，45s；55.9℃，45s；72℃，45s；30個(gè)循環(huán)；72℃，7min。取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析（結(jié)果見(jiàn)圖1）。

1.1.1.4 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切、回收 醇沉淀PCR擴(kuò)增產(chǎn)物、酶切、回收。具體操作方法如下：PCR產(chǎn)物補(bǔ)到100μL，加入等體積異丙醇，置－20℃靜止過(guò)夜，13 000r/min離心15min棄上清，加入600μL 75%乙醇，7 000r/min離心5min，倒掉上清，晾干，加入10μL滅菌去離子水溶解。將醇沉產(chǎn)物進(jìn)行BamHⅠ酶切，體系為20μL：10×Buffer K 2μL，BamHⅠ1μL（15U/μL ，TaKa－Ra），醇沉淀產(chǎn)物10μL，H2O 7μL，37℃酶切1h。將酶切產(chǎn)物繼續(xù)醇沉淀（方法步驟同上）后進(jìn)行HindⅢ（15U/μL，TaKaRa）單酶切，酶切體系同上，回收目的片段。

1.1.2 pQE－pcv581重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將載體pQE－32（QIAGEN）質(zhì)粒用BamHⅠ 和HindⅢ雙酶切，做100μL酶切體系：10×Buffer K 10μL，BamHⅠ2μL，HindⅢ2μL，pQE－32質(zhì)粒 70 μL，H2O 16μL。37℃酶切2h15min，用膠回收試劑盒回收（TIANGEN，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），目的片段和載體常規(guī)方法連接、轉(zhuǎn)化M15、篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒pQE－pcv581。酶切鑒定（見(jiàn)圖2）。

1.2 PCV－2結(jié)構(gòu)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 運(yùn)用Camier－Robson方法（Camier）、Chou－Fasman方法和 Karplus－Schulz方 法 預(yù) 測(cè) PCV－2 去 除 NLS ORF2結(jié)構(gòu)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3 PCV－2結(jié)構(gòu)蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè) 用Kyte－Doolittle方法對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白的疏水性進(jìn)行了分析，用Emini方法預(yù)測(cè)各結(jié)構(gòu)蛋白的表面可能性，以Jameson－Wolf方法預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)蛋白的抗原指數(shù)，然后綜合評(píng)價(jià)PCV－2去除NLS ORF2結(jié)構(gòu)蛋白B細(xì)胞抗原表位的地位。

2 結(jié)果

2.1 pcv－581重組質(zhì)粒的構(gòu)建

2.1.1 PCR擴(kuò)增去除 NLS基因的pcv－581 取5 μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，與標(biāo)準(zhǔn)分子量DL－2 000標(biāo)準(zhǔn)帶型比較，特異條帶分子量位于0.5kb和0.75kb之間，約581bp，符合理論值，以水為對(duì)照未擴(kuò)增出任何條帶（見(jiàn)圖1）。結(jié)果表明，已得到特異性的pcv－581片段。

圖1 pcv－581PCR擴(kuò)增1：Negitive control；2：The PCR product of pcv－581；M：DNA Marker DL－2 000

2.1.2 pQE－pcv581重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將此酶切回收產(chǎn)物5μL上樣，用0.9%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用Marker 19000和Marker DL－2 000同時(shí)比較，獲得符合預(yù)期的目的基因條帶，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定M1：λ－EcoT14Idigest 19329；1：pQE－pcv581digested with BamHⅠand HindⅢ；M2：DNA Marker DL－2 000

2.3 PCV－2結(jié)構(gòu)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) Camier－Robson方法是通過(guò)計(jì)算機(jī)特定氨基酸殘基在特定結(jié)構(gòu)內(nèi)部的可能性來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的。用該方法預(yù)測(cè)PCV－2去除NLS ORF2結(jié)構(gòu)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它沒(méi)有α螺旋形成，但有許多β折疊存在，且分布比較均勻，在各β折疊單元存在長(zhǎng)短不一的轉(zhuǎn)角。該方法預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，在該蛋白的跨膜區(qū)有一些小α螺旋結(jié)構(gòu)形成（見(jiàn)中插彩版圖3）。

Chou－Fasman方法是通過(guò)序列氨基酸的殘基的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)，用該方法預(yù)測(cè)的PCV－2結(jié)構(gòu)蛋白二級(jí)，發(fā)現(xiàn)它有少量α螺旋結(jié)構(gòu)形成，其位置分別在第27～33位、56～65位、89～96位、142～148位、178～186位、191～195位區(qū)段。相應(yīng)的，用該方法預(yù)測(cè)的β折疊和轉(zhuǎn)角的結(jié)構(gòu)就較少并主要在該蛋白的兩端（見(jiàn)中插彩版圖3）。

2.4 PCV－2結(jié)構(gòu)蛋白親水性分析用 Kyte－Doolittle方法對(duì)PCV－2去除NLS ORF2結(jié)構(gòu)蛋白的親水性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，該蛋白存在眾多的疏水性區(qū)域，而且親水性指數(shù)比較高，其中包括第3～77位、98～193位氨基酸殘基，提示該區(qū)域暴露于表面的幾率較大，作為抗原表位的可能性也最大（見(jiàn)中插彩版圖4）。

2.5 PCV－2結(jié)構(gòu)蛋白的表面可能性分析 見(jiàn)中插彩版圖5，PCV－2結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸呈現(xiàn)在表面可能性較大的區(qū)域主要是第7～25位、第44～60位、第96～122位、第133～140位、第164～170位區(qū)段，其他部位展示的可能性較小或表現(xiàn)為負(fù)值。

2.6 PCV－2結(jié)構(gòu)蛋白骨架區(qū)的柔韌性分析 PCV－2結(jié)構(gòu)蛋白骨架區(qū)含有較多的柔韌性區(qū)域，且分布比較均勻，提示該蛋白肽段的柔韌性較大，發(fā)生扭曲、折疊的幾率較高，能形成豐富的二級(jí)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)中插彩版圖6）。

2.7 PCV－2結(jié)構(gòu)蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)分析 通過(guò)聯(lián)合以上蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法分析PCV－2結(jié)構(gòu)蛋白潛在的蛋白抗原決定簇，結(jié)果顯示結(jié)構(gòu)蛋白含有許多抗原指數(shù)較高的區(qū)域，提示該區(qū)段含有潛在優(yōu)勢(shì)抗原表位，如第7～25位區(qū)段，第40～88位區(qū)段，第102～154位區(qū)段、164～173位區(qū)段等（見(jiàn)中插彩版圖7）。這些區(qū)域的抗原指數(shù)也比較高，但是親水性和表面呈現(xiàn)指數(shù)偏低，因此要綜合性看待其作為抗原表位的可能性。

3 討論

3.1 本試驗(yàn)主要是對(duì)去除NLS ORF2的基因進(jìn)行克隆，由于ORF2的特性使其成為在分子水平上特異性檢測(cè)PCV2的理想抗原。由于目前仍然無(wú)有效的措施防治豬圓環(huán)病毒病，因此對(duì)PCV診斷尤為重要。

3.2 本試驗(yàn)借助于計(jì)算機(jī)技術(shù)和生物學(xué)軟件對(duì) PCV2結(jié)構(gòu)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和潛在的B淋巴細(xì)胞抗原表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，分析結(jié)果表明，該蛋白形成主要是用為研制一種適于臨床應(yīng)用的、簡(jiǎn)便、快速的ELISA診斷試劑盒和單克隆抗體的制備奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

［1］ 符芳，王曉武，李曦.一株2型豬圓環(huán)病毒的分離及其序列、致病性的初步分析［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2007，8（3）：78－80.

［2］ Clavk E G.Postweaning mutisystanic wasting syndrome［A］.Proceedings of the American Association of Swine P racticiances［C］.1997：499－501.