袁穎爍，趙敬慧，宋菲菲，劉 曄，張守峰，張樂(lè)萃，扈榮良

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130122）

狂犬?。≧abies）是由狂犬病病毒（RV）感染引起的高致死性人獸共患傳染病，人和所有溫血?jiǎng)游飳?duì)狂犬病病毒都易感，一旦發(fā)病，死亡率幾乎為100%，嚴(yán)重威脅人畜的健康。我國(guó)是受狂犬病危害最為嚴(yán)重的國(guó)家之一。不同毒株的狂犬病病毒N蛋白基因序列具有較高的保守性、同源性和高拷貝復(fù)制的特點(diǎn)，因此可用于狂犬病的分型、診斷、流行病學(xué)分析調(diào)查研究等。

目前可以通過(guò)檢測(cè)組織中的病毒、病毒蛋白（抗原）或基因組RNA（核酸），比較肯定地對(duì)狂犬病作出診斷。具體方法包括：電鏡直接觀察病毒顆粒狀態(tài)、病毒的體內(nèi)或體外分離培養(yǎng)、通過(guò)標(biāo)記的熒光抗體或間接染色的方法檢測(cè)病毒蛋白、反轉(zhuǎn)錄－聚合酶反應(yīng)檢測(cè)病毒的RNA等。另外，狂犬病病毒感染的間接證據(jù)，可通過(guò)檢測(cè)未免疫血清中的病毒中和性抗體或腦脊髓液中存在的抗體確定［1－2］。其中，RT－PCR方法不僅可以檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)的RV，還可以直接用于臨床樣品的檢測(cè)，已廣泛應(yīng)用于狂犬病的實(shí)驗(yàn)室診斷和流行病學(xué)調(diào)查，具有很好的應(yīng)用前景。本研究針對(duì)我國(guó)狂犬病病毒均屬基因1型，且易感動(dòng)物種類(lèi)多、流行毒株可能存在多樣性分布的特點(diǎn)，以N基因保守區(qū)為靶序列設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物，建立了一種特異性好、靈敏度高、簡(jiǎn)便快速的半套式RT－PCR方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Trizol Reagent RNA提取試劑盒（Invitrogen）；One Step RNA PCR Kit（AMV）（TaKaRa），EX－Taq酶等試劑，均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；FITC標(biāo)記的狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體，由軍事獸醫(yī)研究所流行病學(xué)研究室制備。

1.2 主要耗材和儀器 TGRANDIENT PCR儀，購(gòu)自 HYBAID公司；PCR管，購(gòu)自AXYGEN公司；VI Firereader XS凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自華粵行公司；DYFⅢ2型電泳儀，購(gòu)自Bio－Rad公司。

1.3 毒株、乳鼠及病料 CVS－11、SRV9、ERA、Flury－LEP細(xì)胞毒、CVS－24腦毒以及23株RABV野外分離株（＊）均為本實(shí)驗(yàn)室保存，其他臨床病料信息見(jiàn)表2；新生ICR乳鼠（清潔級(jí)），由吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 半套式RT－PCR檢測(cè)方法的建立

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 參考GenBank公布的RV N基因全序列進(jìn)行同源性比較分析，選取序列中保守的區(qū)域，根據(jù)RT－PCR引物設(shè)計(jì)原則，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了2對(duì)半套式RT－PCR引物。（引物信息見(jiàn)表1）外套引物（NF/NR1）擴(kuò)增片段長(zhǎng)874bp，內(nèi)套引物（NF/NR2）擴(kuò)增片段長(zhǎng)508bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，使用時(shí)用DEPC水稀釋至10μmol/L。

表1 引物序列

1.4.2 細(xì)胞毒和臨床病料總RNA的提取 參考Trizol Reagent RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.3 一步法RT反應(yīng)及外套R(shí)T－PCR反應(yīng) 參照One Step RNA PCR Kit（AMV）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將提取好的總RNA沉淀中加入23μL的Rnase Free H2O使之溶解后，直接加入如下體系的PCR管中：10×One Step RNA PCR Buffer 5.0μL，MgCl2（25mmol/L）10μL，dNTP Mixture（各 10 mmol/L）5.0μL，RNase Inhibitor（40U/μL）1μL，AMV RTase XL（5U/μL）1μL，AMV－OptimizedTaq（5U/μL）1μL，上游引物 NF（10μmol/L）2 μL，下游引物 NR1（10μμmol/L）2μL，總體積50 μL。經(jīng)50℃水浴30min后，直接進(jìn)行外套PCR反應(yīng)，也可立即放置－70℃保存?zhèn)溆?。外套PCR循環(huán)步驟為：94℃，3min→（94℃，30s→59℃，30s→72℃，40s）30個(gè)循環(huán)→72℃，8min延伸。

1.4.4 半套式 RT－PCR 取2μL PCR外套擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，建立50μL內(nèi)套PCR反應(yīng)體系如下：PremixTaq25μL，上游引物NF（10μmol/L）2μL，下游引物 NR2（10μmol/L）2μL，2ddH2O 19μL。內(nèi)套PCR循環(huán)步驟為：94℃，3min→（94℃，30s→64℃，30s→72℃，30s），30個(gè)循環(huán)→72℃，7min延伸。

1.5 靈敏度試驗(yàn) 將SRV9弱毒株細(xì)胞培養(yǎng)物（約10－4.25TCID50/mL）用0.01mol/L 1×PBS（pH 值7.4）進(jìn)行1×10－1～1×10－1010倍系列稀釋?zhuān)謩e取200μL按照上述方法提取總RNA后進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.6 特異性試驗(yàn)

1.6.1 非狂犬病病毒的檢測(cè) 采用上述方法對(duì)犬瘟熱病毒（CDV）、犬細(xì)小病毒（CPV）、犬腺病病毒（CAV）、偽狂犬病病毒（PRV）等幾種非狂犬病病毒進(jìn)行RNA或DNA提取，首先用病毒提供者建議的RT－PCR或PCR方法對(duì)各病毒進(jìn)行鑒定，，并設(shè)陰性對(duì)照，鑒定成功后再進(jìn)行半套式RT－PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的特異性。其中，CPV、CAV、PRV為DNA病毒，可直接進(jìn)行半套式RT－PCR，CDV為RNA病毒，檢測(cè)步驟與RV完全相同。

1.6.2 不同動(dòng)物腦組織的檢測(cè) 用該方法對(duì)犬、鼬獾（江西）、黃鼠狼等3種不同易感的腦組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與FAT試驗(yàn)相比較，以確定所建立方法對(duì)狂犬病病毒易感動(dòng)物檢測(cè)的特異性（樣品信息見(jiàn)表2）。

表2 檢測(cè)用不同動(dòng)物腦組織的背景信息及試驗(yàn)

1.7 敏感性試驗(yàn) 分別對(duì) CVS－11、SRV9、ERA、Flury－LEP、CVS－24和本實(shí)驗(yàn)室保存的23株野外分離株腦毒進(jìn)行半套式RT－PCR和FAT同步檢測(cè)，驗(yàn)證引物的敏感性及兩者符合情況。

2 結(jié)果

2.1 半套式RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果 在優(yōu)化了PCR條件的基礎(chǔ)上，本研究建立了一種以N基因?yàn)榘行蛄械陌胩资絉T－PCR方法。結(jié)果顯示，陽(yáng)性樣品可擴(kuò)增出特異性目的片段，且背景清晰，無(wú)拖帶現(xiàn)象，而陰性對(duì)照無(wú)特異條帶。

2.2 靈敏度試驗(yàn) 經(jīng)外套擴(kuò)增可見(jiàn)到大小為874 bp的特異性目的片段；經(jīng)內(nèi)套擴(kuò)增后，1×10－3倍稀釋的細(xì)胞毒也可見(jiàn)到508bp的特異擴(kuò)增產(chǎn)物，即對(duì)SRV9細(xì)胞毒的檢測(cè)靈敏度可達(dá)到0.01個(gè)TCID50/mL（圖1）。

2.3 特異性試驗(yàn)

2.3.1 非狂犬病病毒的檢測(cè) 針對(duì)犬瘟熱病毒（CDV）、犬細(xì)小病毒（CPV）、犬腺病病毒（CAV）、偽狂犬病病毒（PRV）等非狂犬病病毒的RT－PCR或者PCR方法檢測(cè)均擴(kuò)增出陽(yáng)性目的片段，陰性對(duì)照成立，而用上述方法病毒樣品均未表現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。

2.3.2 不同動(dòng)物腦組織的檢測(cè) 對(duì)犬、鼬獾、黃鼠狼等樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均有特異性目的條帶出現(xiàn)。24例免疫熒光抗體試驗(yàn)（FAT）確定為陽(yáng)性的樣品，在半套式RT－PCR中均為陽(yáng)性；FAT為陰性的樣品，在半套式RT－PCR中2例為擴(kuò)增陽(yáng)性，將樣品進(jìn)行小鼠腦內(nèi)接種試驗(yàn)（MIT），取死亡小鼠腦做FAT試驗(yàn)，結(jié)果呈陰性；將腦組織樣品在37℃放置72h后，用半套式RT－PCR法仍可檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果。新鮮樣品檢測(cè)為陰性的樣品，以同樣條件放置后仍為擴(kuò)增陰性（見(jiàn)圖2、表2）。

圖1 半套式RT－PCR檢測(cè)SRV9細(xì)胞培養(yǎng)物的電泳圖

圖2 半套式RT－PCR檢測(cè)RV易感動(dòng)物腦組織的電泳

2.4 敏感性試驗(yàn) 分別對(duì) CVS－11、SRV9、ERA、Flury－LEP細(xì)胞毒和CVS－24腦毒及本實(shí)驗(yàn)室保存的23株野外分離株腦毒進(jìn)行半套式RT－PCR檢測(cè)及腦毒FAT同步檢測(cè)，均獲得陽(yáng)性結(jié)果，敏感性較高。

3 討論

本試驗(yàn)針對(duì)基因Ⅰ型狂犬病毒（RV）并偏顧于我國(guó)固定毒株和流行性毒株，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，建立了一種特異檢測(cè)RV的半套式RT－PCR方法，該方法不僅可以檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)的RV，還可以直接用于臨床樣品的檢測(cè)。世界衛(wèi)生組織推薦FAT為診斷人和動(dòng)物狂犬病快速而敏感的金標(biāo)方法［3］，但該方法也有其局限性。例如，它需要熒光顯微鏡的支持且耗時(shí)較長(zhǎng)［4］，并且結(jié)果受抗體質(zhì)量的影響很大，病毒細(xì)胞培養(yǎng)則存在病變是否產(chǎn)生的問(wèn)題［5］，另外，它對(duì)樣本的新鮮度有一定要求，在腐敗樣品的檢測(cè)中敏感度下降，易出現(xiàn)假陰性，且在暗環(huán)境中進(jìn)行大量樣品檢測(cè)時(shí)，工作人員易產(chǎn)生視覺(jué)疲勞，從而造成誤判、漏判。本試驗(yàn)所建立的半套式RT－PCR方法特異性和敏感性均較高，檢測(cè)結(jié)果直觀，更適合大量樣品的檢測(cè)工作，且基本克服了FAT對(duì)腐敗樣品檢測(cè)的問(wèn)題。值得一提的是，考慮到多樣品檢測(cè)時(shí)半套式RT－PCR可能存在的漏檢和交叉污染現(xiàn)象，本研究采用一步法RT－PCR，反轉(zhuǎn)錄和PCR均在同一管中進(jìn)行熱循環(huán)，無(wú)需打開(kāi)管蓋，操作簡(jiǎn)便快速，避免了批量樣品檢測(cè)時(shí)存在的的交叉污染問(wèn)題［6］。本研究設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增片段含蓋了不同毒株間N基因變異最大區(qū)域［7］，有助于狂犬病的分子生物學(xué)診斷和流行病學(xué)調(diào)查分析。本研究對(duì)36份腦組織樣品分別進(jìn)行了檢測(cè)，共檢出23份陽(yáng)性腦組織，與FAT檢測(cè)結(jié)果完全一致。該方法能從腐敗樣品中檢出病毒RNA，更適用于腐敗樣品的檢測(cè)，條件優(yōu)化后，RNA提取到獲得結(jié)果僅用5h即可完成狂犬病的檢測(cè)，可用于我國(guó)狂犬病臨床樣品的定性檢測(cè)和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查研究，為控制狂犬病工作提供有力的技術(shù)保障。

［1］ Meslin F X，Kaplan M M，Koprowski H，eds.Laboratory techniquesinrabies4thed Geneva World Health Organization，1996.

［2］ 扈榮良.狂犬病理論、技術(shù)與防治［M］.北京：科學(xué)出版社，2007：92.

［3］ WHO Expert Committee on Rabies Ninth report Geneva World Health Organization［J］.2004（WHO Technical Report Series，No.931）.

［4］ Woldehiwet Z.Clinicallaboratoryadvancesinthedetectionof rabiesvirus［J］.Clin Chim Acta，2005，351（1－2）：49－63.

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