蔣 卉，戴志紅，王在時，關(guān)孚時，郭彩云，李 翠，溫 芳，陸連壽

（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀 100081）

豬瘟是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種高度接觸性傳染病。近年來，該病在美洲、亞洲、歐洲等國家和地區(qū)呈現(xiàn)散發(fā)的趨勢，一些宣布已消滅豬瘟的國家又見豬瘟復(fù)發(fā)的報道［1］。該病尚無特效的治療藥物和方法，疫苗和疫苗接種是我國防治豬瘟的主要手段。20世紀(jì)50年代中期，中國學(xué)者成功培育出了豬瘟兔化弱毒株，簡稱“C株”［2］。1957年我國開始推廣豬瘟兔化弱毒疫苗，開始采用家兔淋脾組織苗、后發(fā)展出乳兔組織苗、牛體反應(yīng)苗，或以原代豬腎細胞、羊腎細胞、牛睪丸細胞培養(yǎng)的細胞苗［3］。

豬瘟兔化弱毒疫苗效力檢驗是保證疫苗質(zhì)量和有效性的關(guān)鍵。根據(jù)中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程（2000版）規(guī)定，效力檢驗可采取用家兔效檢或用豬效檢。在實際生產(chǎn)過程中，用豬效檢成本較高，周期較長，故多選用家兔效檢。通過家兔體溫反應(yīng)和攻毒結(jié)果綜合判定疫苗效力，然而體溫反應(yīng)多會受到家兔品種、個體差異、健康狀況等的影響。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法）是近年來飛速發(fā)展的一種免疫檢測方法，是OIE指定的檢測豬瘟抗體的可行方法［4］。本文采用IDEXX商品化的豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒對注射豬瘟兔化弱毒家兔血清樣品進行檢測，并且與體溫反應(yīng)結(jié)果進行比較，以便為ELISA方法應(yīng)用于家兔效檢提供依據(jù)。

1 材料與方法

材料

1.1.1 家兔 體重約2kg的健康大耳白兔，由瑞普保定生物藥業(yè)有限公司提供。

1.1.2 IDEXX豬瘟抗體ELISA檢測（以下簡稱IDEXX試劑盒） 試劑盒為美國IDEXX公司生產(chǎn)，試劑盒放置2℃～8℃保存。

1.1.3 豬瘟兔化弱毒毒種 病毒含量0.1g/支，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，－70℃保存，用于作為本試驗的陽性對照。

1.1.4 試驗用豬瘟兔化弱毒 病毒含量0.02g/支，由本實驗室制備，－70℃保存，作為試驗樣品稀釋接種家兔。

1.1.5 酶標(biāo)儀 TECAN sunrise酶標(biāo)儀。

方法

1.2.1 抗體檢測時間的選擇 將1支本實驗室制備豬瘟兔化弱毒樣品先用生理鹽水稀釋成0.01g/mL，后分別做1/150、1/300、1/450、1/600、1/750倍稀釋，共5個稀釋度。每個稀釋度注射2只家兔，設(shè)豬瘟兔化弱毒毒種為陽性對照，注射2只家兔。按文獻［5］方法觀察體溫反應(yīng)，并于3d、5d、7d、10d、15d、20d、25d、30d家兔耳動脈采血1mL，分離血清用IDEXX豬瘟抗體ELISA試劑盒檢測，確定家兔血清豬瘟抗體的檢測時間。

1.2.2 接種與測溫觀察 將2支本實驗室制備豬瘟兔化弱毒樣品先用生理鹽水稀釋成0.01g/mL，后分別做1/150、1/300、1/450、1/600、1/750倍稀釋，依次類推稀釋到1/2 100倍，共14個稀釋度。每個稀釋度注射2只家兔，設(shè)豬瘟兔化弱毒毒種為陽性對照，注射2只家兔。生理鹽水注射2只家兔為陰性對照，按文獻［5］方法觀察體溫反應(yīng)。

1.2.3 抗體檢測與攻毒 根據(jù)抗體檢測時間的選擇試驗結(jié)果，在接種豬瘟兔化弱毒后10d家兔耳動脈采血1mL，分離血清用IDEXX豬瘟抗體ELISA試劑盒檢測。并按文獻［5］方法對部分家兔進行攻毒試驗，觀察體溫反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 抗體檢測時間的確定 接種5個不同稀釋度豬瘟兔化弱毒后，家兔的體溫反應(yīng)結(jié)果見表1，不同時間采集的血清樣品抗體ELISA檢測結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，所有家兔均產(chǎn)生了定型熱反應(yīng)（＋＋）或輕熱反應(yīng)（＋）。所有家兔在接種后3d和5d采集的血清樣品豬瘟抗體檢測結(jié)果均為陰性。7d采集的血清樣品中，1/150倍稀釋度下S2號家兔血清豬瘟抗體檢測為可疑，陽性對照組S11號家兔血清豬瘟抗體檢測為可疑，其余家兔血清樣品豬瘟抗體檢測結(jié)果均為陰性。10d采集的家兔血清樣品豬瘟抗體檢測結(jié)果均為陽性，以后每隔5d直至接種后30d所采集的家兔血清樣品豬瘟抗體檢測結(jié)果均為陽性，ELISA阻斷率無明顯降低。通過該試驗結(jié)果確定接種豬瘟兔化弱毒后，家兔血清豬瘟抗體檢測時間為10d。

表1 5個稀釋度家兔熱型判定

2.2 家兔測溫和抗體ELISA檢測結(jié)果 2支豬瘟兔化弱毒樣品做14個不同稀釋度接種后，家兔測溫結(jié)果以及兔血清豬瘟抗體ELISA檢測結(jié)果見表2。結(jié)果表明，除陰性、陽性對照組外，28組家兔接種不同稀釋度豬瘟兔化弱毒后，有24組出現(xiàn)了2只家兔均為定型熱反應(yīng)（＋＋），或者1只家兔為定型熱反應(yīng)，另1只家兔為輕熱反應(yīng)（＋），其中23組家兔血清豬瘟抗體檢測均為陽性，兩者符合率可達95.83%，1組家兔雖表現(xiàn)為定型熱反應(yīng)和輕熱反應(yīng)，但輕熱反應(yīng)家兔血清豬瘟抗體檢測為陰性。28組家兔中有4組沒有表現(xiàn)出典型的熱反應(yīng)：1/1 500稀釋度1號樣品組中19號兔為可疑反應(yīng)（±），19′號兔為輕熱反應(yīng)，但2只家兔血清豬瘟抗體檢測均為陽性；1/1 950稀釋度2號樣品組26號兔為無反應(yīng)（－），26′號兔為可疑反應(yīng)（±），其血清豬瘟抗體檢測均為陰性；1/2 100稀釋度1號樣品組中2只家兔均為輕熱反應(yīng)，血清豬瘟抗體檢測均為陽性；2號樣品組中28號兔可疑反應(yīng)，血清豬瘟抗體檢測陽性，28′號兔無反應(yīng)，其血清豬瘟抗體檢測陰性。

根據(jù)接種后家兔體溫反應(yīng)和熱型判定結(jié)果，對沒有出現(xiàn)典型熱反應(yīng)的4組家兔進行攻毒試驗，同時設(shè)2只陽性對照兔，攻毒測溫結(jié)果見表3。結(jié)果表明，ELISA豬瘟抗體檢測為陰性的家兔攻毒后均出現(xiàn)了定型熱反應(yīng)，而豬瘟抗體檢測為陽性的家兔攻毒后出現(xiàn)了無反應(yīng)、輕熱反應(yīng)和可疑反應(yīng)的3種不同反應(yīng)類型。綜合分析說明，家兔體溫反應(yīng)與ELISA抗體檢測結(jié)果具有較高的正相關(guān)性，特別是在低稀釋度的組別中兩項結(jié)果的符合率達到100%，在高稀釋度組別的判定中ELISA方法的敏感度更好。在家兔效力檢驗中根據(jù)體溫反應(yīng)判定結(jié)果，其結(jié)果會受到家兔個體差異等原因影響，而ELISA方法用于家兔效力檢驗的判定，其敏感性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性更佳。

圖1 各稀釋度家兔血清抗體ELISA檢測ELISA阻斷率≤30%判為陰性；ELISA阻斷率≥40%判為陽性；30%＜ELISA阻斷率＜40%判為可疑

表2 14個不同稀釋度家兔熱型判定和血清豬瘟抗體ELISA檢測

表3 攻毒后家兔熱型判定

3 討論

ELISA方法目前已在實踐中被廣泛用于豬瘟抗體的檢測，在疫苗的免疫效果評價和陰性豬篩選工作中發(fā)揮了巨大作用。與其他血清學(xué)檢測方法相比，該方法具有操作簡便、快速的特點［6］，其結(jié)果更具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。本試驗通過比較豬瘟兔化弱毒疫苗家兔效力檢驗體溫反應(yīng)與豬瘟抗體ELISA檢測結(jié)果的相關(guān)性，給出了ELISA方法用于家兔效力檢驗的可行性。雖然本研究依然采用家兔進行效檢，但省去了傳統(tǒng)方法每6h家兔測溫1次的工作，大大減輕疫苗檢驗工作的強度，避免了傳統(tǒng)方法中因家兔質(zhì)量和環(huán)境等因素對體溫檢測結(jié)果的影響。家兔血清豬瘟抗體ELISA結(jié)果比體溫反應(yīng)更準(zhǔn)確直接地反映了活疫苗的效力，提高了檢測結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性。

本研究通過檢測接毒后不同時間的家兔血清豬瘟抗體，確定采血檢測豬瘟抗體的最佳時間為10d。10d以前家兔血清抗體ELISA檢測基本都為陰性，ELISA阻斷率較低。10d家兔血清豬瘟抗體ELISA檢測全為陽性，ELISA阻斷率達到較高值，以后至30d家兔血清豬瘟抗體ELISA檢測阻斷率無明顯下降。在確定抗體檢測時間的試驗中，只選擇了1/150、1/300、1/450、1/600、1/750倍這5個較低稀釋倍數(shù)注射家兔，監(jiān)測不同時間家兔血清抗體變化，以確保有足夠的病毒量使機體產(chǎn)生抗體。盡管本方法比起傳統(tǒng)體溫反應(yīng)的判定時間有所延長，但是可以有效地排除體溫檢測中輕熱反應(yīng)和可疑反應(yīng)帶來的不確定性，避免再進行攻毒試驗，從而提高檢驗工作的效率和檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

通過比較分析，本試驗的各項結(jié)果，表明IDEXX豬瘟抗體ELISA試劑盒檢測結(jié)果與家兔體溫反應(yīng)結(jié)果有很高的符合率，在病毒高稀釋度條件下，豬瘟抗體ELISA檢測可以有效地對體溫反應(yīng)可疑或者輕熱的家兔進行判定，避免了體溫反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生的不確定性，同時省去了攻毒試驗的工作量。本試驗只使用了一種商品化的豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒，該種試劑盒目前在國內(nèi)使用廣泛，具有一定代表性。其他商品化的豬瘟抗體ELISA試劑盒是否與家兔體溫反應(yīng)有較好相關(guān)性還需要進一步的試驗驗證。但是本試驗可以為ELISA方法用于家兔效力檢驗提供有力依據(jù)。

［1］ Stegeman A，Elbers A，de Smit H ，etal.The 1997－1998 epidemic of classical swine fever in the Netherlands［J］.Vet Microbiol，2000，73：183－196.

［2］ 仇華吉，童光志，沈榮顯.豬瘟兔化弱毒疫苗－半個世紀(jì)的回顧［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（8）：1675－1685.

［3］ 朱良全，彭雋，王棟.豬瘟疫苗研究進展及我國傳統(tǒng)疫苗的研究現(xiàn)狀［J］.中國獸藥雜志，2005，39（2）：33－37.

［4］ 高金源，陳曉春，吳華偉，等.豬瘟抗體陰性豬篩選方法的比較［J］.中國獸藥雜志，2011，45（1）：20－21.

［5］ 農(nóng)業(yè)部第四屆獸用生物制品規(guī)程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程（2000年版）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

［6］ 苗得園.Herdchek豬瘟抗體ELISA試劑盒在豬瘟控制中的應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)雜志，2006，42（11）：50－51.