秦曉慶，趙樹臣，侯振中

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

空腸彎曲桿菌（C.jejuni）是一種在世界范圍內(nèi)受到廣泛重視的人畜共患病的病原（Tauxe，1992），該菌生長條件苛刻，使得在分離和實(shí)驗室維持培養(yǎng)的過程具有一定的難度。而關(guān)于該菌雖具極敏感的特性，卻依然能在環(huán)境中存活并致病的原因，目前仍使人困惑。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)C.jejuni能夠形成一種被稱之為“生物膜”的聚集體［1－2］。細(xì)菌生物膜是一種特殊的菌體生存和生長的方式，它能夠保護(hù)菌體細(xì)胞免受不良環(huán)境的傷害，如紫外線、吞噬以及干燥［3］。

本試驗從建立該菌的體外生物膜模型入手，采用結(jié)晶紫染色以及光鏡和掃描電鏡的方法對其進(jìn)行鑒定，用正交法對3種環(huán)境因素對該菌生物膜形成的影響進(jìn)行研究，希望掌握其規(guī)律及特性，為該菌生物膜形成的阻斷和消除提供有價值的信息。

1 試驗材料

1.1 試驗菌落C.jejuni臨床分離株，分離菌株的病料采集于哈爾濱市某屠宰場。

1.2 培養(yǎng)基試劑及儀器 改良的Camp－BAP分離培養(yǎng)基、布氏增菌肉湯；PCR Master Mix、DNA Marker、Taq酶、電泳用瓊脂糖、EB；結(jié)晶紫染液，乙醇，戊二醛，四氧化鋨，乙酸異戊酯等；超凈工作臺、厭氧培養(yǎng)罐、電熱恒溫培養(yǎng)箱、水套二氧化碳培養(yǎng)箱、紫外可見分光光度計、倒置熒光顯微鏡、掃描電鏡等。

2 試驗方法

2.1 細(xì)菌的分離與鑒定

2.1.1 細(xì)菌的分離 將樣本劃線接種于改良的Camp－BAP培養(yǎng)基上，接種后的平板微需氧條件、42℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h～72h［4］。分離到的細(xì)菌經(jīng)過2～3次選擇培養(yǎng)基純化。

2.1.2 病原菌的鑒定 挑取疑似菌落涂片并進(jìn)行革蘭染色，置于顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。初步確定為空腸彎曲桿菌后，對其進(jìn)行相應(yīng)的生化鑒定和PCR鑒定。

常規(guī)生化檢測，參照國家標(biāo)準(zhǔn)SN0175－92以及GB/T 4789.28－2003判定；PCR檢測的具體方法均參考朱建國等［5］所建立的用于C.jejuni的快速PCR鑒定的方法，該方法對C.jejuni可以特異的擴(kuò)增出516bp條帶，上述流程中所涉及的引物合成及電泳產(chǎn)物的測序等均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

2.2C.jejuni生物膜體外模型建立及鑒定

2.2.1C.jejuni生物膜形成能力的分析 布氏肉湯增菌，微需氧，42℃培養(yǎng)48h～72h，得到C.jejuni濃菌液，無菌布氏肉湯調(diào)整菌液濃度至OD600＝0.2。取上述菌液5mL接種于含20mL無菌布氏肉湯的錐形瓶中。將聚苯乙烯片（2×2cm）作為生物膜載體放置到錐形瓶中［6］。

設(shè)試驗組和空白對照組（即不接種菌液），42℃厭氧靜置培養(yǎng)5d，每隔1d取出3個樣本，肉眼觀察是否有膜樣物質(zhì)附著，結(jié)晶紫染色后置于電鏡和掃描電鏡下觀察。

2.2.2C.jejuni生物膜模型的鑒定 樣本經(jīng)1%結(jié)晶紫染色后需經(jīng)過光學(xué)顯微鏡（×400）以及掃描電鏡（SEM）鑒別是否建模成功。其中，掃描電鏡樣本處理步驟如下所示［7］：

（1）25mL/L的戊二醛溶液于4℃固定24h，PBS沖洗；（2）1mL/L的四氧化鋨溶液4℃固定4 h，PBS沖洗；（3）300、500、700、800、900mL/L 和100mL/L乙醇梯度脫水；（4）乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥儀內(nèi)干燥4h；（5）真空噴金；（6）掃描電鏡觀察并拍照。

2.3 正交法檢測環(huán)境因素對C.jejuni生物膜形成的影響 增菌并調(diào)整濃度為OD600＝0.2±0.01。按照L9（34）設(shè)計正交試驗，正交試驗因素及水平見表1。

表1 正交實(shí)驗因素及水平

C.jejuni生物膜形成的水平采用結(jié)晶紫法進(jìn)行檢測，步驟如下［8］：（1）試管法培養(yǎng)C.jejuni生物膜5d；（2）無菌PBS沖洗3次；（3）3%戊二醛固定20min后，37℃烘干；（4）1%結(jié)晶紫染色30min，棄去染液，去離子水沖洗，干燥；（5）20%丙酮－乙醇溶液溶解。紫外分光光度計測OD600值，取均值。

3 試驗結(jié)果

3.1 菌株的分離及鑒定 劃線培養(yǎng)后得到疑似C.jejuni的菌落，菌落扁平、灰色不閃光、半透明、白色、棕黃色凸起、邊緣不整齊、有時沿接種線擴(kuò)散。革蘭染色陰性，光學(xué)顯微鏡下呈現(xiàn)出與C.jejuni相吻合的形態(tài)學(xué)特征，例如小逗點(diǎn)狀，或者兩菌體相連呈現(xiàn)出S形、海鷗形或螺旋狀。

對菌株進(jìn)行常規(guī)的生化鑒定和PCR鑒定，結(jié)果12個樣本中分離的菌株有6株與C.jejun的生化特性相符，進(jìn)一步進(jìn)行PCR鑒定的結(jié)果為：生化鑒定的6株C.jejuni陽性菌中有2株得到了特異性片段，該片段長度為516bp［5］。PCR產(chǎn)物測序進(jìn)一步證實(shí)了該2株菌為C.jejuni。

3.2C.jejuni生物膜體外模型的建立結(jié)果 經(jīng)過5d的靜置培養(yǎng)，可見該菌能在載體上形成肉眼可見的膜狀物，而空白對照組的載體上則沒有膜狀附著，初步斷定該菌具有生成生物膜的能力。

染色后，將載體置于油鏡下（×400）可以觀察到從菌體聚集到逐步形成片狀，最后形成膜狀覆蓋在載體上的過程，初步斷定建模成功（見中插彩版圖1）。掃描電鏡觀察，可以從更微觀的層次觀察到菌體相互間連接、粘附、聚集直至形成團(tuán)狀或是片狀的過程，見圖2。

3.3 環(huán)境因素對C.jejuni生物膜形成的影響 環(huán)境因素對C.jejuni生物膜形成的影響，通過正交試驗后結(jié)果如表2所示。從表2中可以看出，3種因素中，對該菌生物膜形成影響從大到小依次是空氣條件、溫度、培養(yǎng)基（RA＞RC＞RB）。而同一因素處于不同水平時，生物膜的形成也有所差異，綜上，可得出C.jejuni生物膜形成的最佳條件為A2，B1，C3，即在常規(guī)的空氣條件下，37℃，MHB培養(yǎng)基，該菌的生物膜形成最為理想。

4 討論

生物膜的形成是細(xì)菌對抗抗生素和機(jī)體免疫系統(tǒng)的一種手段，也是感染由急性轉(zhuǎn)為慢性或持續(xù)性感染的原因之一［9］。C.jejuni是一種世界范圍內(nèi)普遍存在的人畜共患病的病原，對各種動物均可感染，豬感染本病的主要癥狀為腹瀉，因此本試驗選取有腹瀉癥狀的豬作為采樣對象，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義和可行性。對于環(huán)境因素對該菌生物膜的影響方面，Reuter［3］和 Reeser［2］曾提出有氧的環(huán)境更容易促進(jìn)C.jejun生物膜的形成，而 Fields［11］、Mclennan［12］也分別報道了營養(yǎng)豐富并不利于該菌生物膜的形成，上述結(jié)論都在本試驗中得到了驗證。分析C.jejuni臨床株形成生物膜的能力，觀察生物膜從粘附到成熟的過程并研究其影響因素，對于進(jìn)一步研究對生物膜形成的阻斷或清除，進(jìn)而用于對該菌耐藥性的消除具有重要的意義。

圖2 掃描電鏡觀察生物膜形成的過程 （a→b→c）

表2 正交試驗

然而，生物膜形成的機(jī)制非常復(fù)雜，體外模型的建立只能作為生物膜形成的簡單模擬，要想進(jìn)一步了解該病原菌生物膜的形成機(jī)制以及其在細(xì)菌耐藥性方面的作用原理上還需要更大量的研究。

［1］ Buswell C M，Herlihy Y M，Lawrence L M.Extended survival and persistence of Campylobacter spp.in water and aquatic biofilms and their detection by immunofluorescent－an －tibody and－rRNA staining［J］.Appl Environ Microbiol，1998，64：733－741.

［2］ Ryan J，Reeser Robert T，Medler Stephen J.Billington.Characterization of Campylobacter jejuni Biofilms under Defined Growth Conditions［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73（6）：1908－1913.

［3］ Mark Reuter，Arthur Mallett，Bruce M.Biofilm Formation byCampylobacterjejniIs Increased under Aerobic Conditions［J］.Applied and Environmental Microbiology，2010，76（7）：2122－2128.

［4］ 朱建國，侯建軍，姜毅，等.空腸彎曲桿菌的微需氧分離培養(yǎng)辦法.上海交通大學(xué)，200810202320［P］.2009－03－25.

［5］ 朱建國，侯建軍，華修國，等.空場彎曲桿菌的聚合酶鏈?zhǔn)綑z測反應(yīng)，上海交通大學(xué)：200810042787［P］.2009－01－28.

［6］ Teixeiraa P，Lopesb Z，Azeredoa J，etal.Physico－chemical surface characterization of a bacterial population isolated from a milking machine Food Microbiol，2005，22：247－251.

［7］ 胡錦松，陳豪泰，張杰，等.細(xì)菌生物膜鑒定方法的研究進(jìn)展［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2010，40（11）：1194－1199.

［8］ Tauxe RV.Epidemiology ofCampylobacterjejuniinfections in the United States and other industrial nations.In：Nachamkin I，Blaser M J，Tompkins L S，editiors.Campylobacter jejuni：current and future trends［J］.Washington：American Society for Microbiology，1992，9－12.

［9］ 李靜，馬勛.糞腸球菌生物膜的形成及影響因素［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008，30（7）：523－526.

［10］陽成波，蔣原.空腸彎曲桿菌感染流行病學(xué)研究進(jìn)展［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2002，23（6）：10－13.

［11］Fields J A，Thompson S A.Campylobacter jejuni CsrA mediates oxidative stress responses，biofilm formation，and host cell invasion［J］.Bacteriol，2008，190：3411－3416.

［12］Mclennan M K，Ringoir D D.Campylobacter jejuni biofilms up－regulated in the absence of the stringent response utilize a calcofiuor white－reactive polysaccharide ［J］.J Bacteriol，2008，190（3）：1097－1107.