施金鳳 于 河 王 上 谷曉紅

(1河南省鄭州市第二中醫(yī)院，鄭州，450002;2北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029;3湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢，430061)

小兒臟腑嬌嫩，形氣未充，肺脾常不足，且寒暖不能自調(diào)，乳食不知自節(jié)易于形成食積，外易受六淫所侵而發(fā)病，臨床多以呼吸系統(tǒng)為多[1]。加之小兒體屬“純陽(yáng)”，呼吸道黏膜防御機(jī)制不夠完善，故感邪易從熱化而成急性外感熱病。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為積食積熱可促進(jìn)肺熱證的發(fā)生、發(fā)展，如葉天士所言:“胃腸為市，故陽(yáng)明為成溫之藪也”。臨床發(fā)現(xiàn)，食積小兒容易發(fā)生急性呼吸系統(tǒng)感染，而具體病理機(jī)制尚待進(jìn)一步發(fā)掘探索。有研究發(fā)現(xiàn)流感病毒感染與機(jī)體免疫功能失調(diào)有密切關(guān)系[2]，而細(xì)胞因子在感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。有學(xué)者認(rèn)為T輔助淋巴細(xì)胞TH1/TH2的功能可以反應(yīng)機(jī)體促炎和抗炎反應(yīng)的失衡情況[3]。TH1細(xì)胞主要分泌干擾素γ，TH2細(xì)胞則主要分泌IL－4，本研究試圖從TH1(IFN－γ)和TH2(IL－4)平衡的角度來(lái)探討食積因素在病毒感染狀態(tài)下細(xì)胞因子譜的改變，以明確其對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。嘗試揭示食積影響肺系熱證的發(fā)展變化的作用機(jī)制，為臨床肺胃同治提供依據(jù)，對(duì)于急性呼吸系統(tǒng)傳染病的防治有一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 昆明小鼠，雄性，體重11～13 g，180只，清潔級(jí)，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2006－0009]。購(gòu)入后置免疫教研室動(dòng)物房實(shí)驗(yàn)動(dòng)物潔凈柜飼養(yǎng)。將小鼠按體重隨機(jī)分為3組:正常組、單純感染組、食積感染組，每組60只。

1.2 模型制作 正常組:正常飼料，不限食水。從實(shí)驗(yàn)第1天起，予生理鹽水按0.2 mL/10 g灌胃，2次/d，共灌胃4 d。于第5天乙醚麻醉后，給予生理鹽水50 μL滴鼻。單純感染組:正常飼料，不限食水。從實(shí)驗(yàn)第1天起，予生理鹽水按0.2 mL/10 g灌胃，2次/d，共灌胃4 d。于第5天乙醚麻醉后，予FM1流感病毒50 μL滴鼻。食積感染組:自制高蛋白、高熱量飼料(豆粉、面粉、牛奶粉、魚肉松，四者按2∶1∶1∶1 比例配制)，不限食水。從實(shí)驗(yàn)第1天起，予52%濃度的牛乳按0.2 mL/10 g灌胃，2次/d，共灌胃4 d。于第5天乙醚麻醉后，予流感病毒50 μL滴鼻。

1.3 主要試劑及藥物 免疫球蛋白M酶聯(lián)免疫試劑盒IgM(201103)ELISA;白介素4酶聯(lián)免疫試劑盒IL－4(201102)ELISA、干擾素γ酶聯(lián)免疫試劑盒IFN－γ(201102)ELISA IT:北京康源瑞得生物技術(shù)有限公司提供;病毒:流感病毒亞洲甲型鼠肺適應(yīng)株(FM1)由北京中醫(yī)藥大學(xué)免疫學(xué)教研室提供，LD50為10－3.7，4LD50的流感病毒液為1∶150;乙醚、乙醇、生理鹽水。

1.4 觀察項(xiàng)目 1)小鼠體征;2)體重:從實(shí)驗(yàn)第1天開始，連續(xù)記錄小鼠體重，至取材前;3)正常組與單純感染組、單純感染組分別在感染病毒后第1、3、5天，各組每次取20只小鼠，摘眼球取血，其中每組中的10只，靜置后低溫離心(1000 r/min)，離心15 min，留取血清，將血清置于－80℃冰箱中備用，行酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)測(cè)各組小鼠血清IL－4、IFN－γ含量;每組中另外的10只，靜置后低溫離心(3000 r/min)，離心10 min，留取血清，將血清置于－80℃冰箱中備用，行酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)測(cè)各組小鼠血清特異性抗體IgM含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)均值以±s表示，進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體征 正常組小鼠糞便質(zhì)粗，量多，未見(jiàn)明顯異常。單純感染組小鼠活動(dòng)減少，扎堆，聳毛，毛無(wú)光澤，蜷縮，活動(dòng)減少，糞便質(zhì)粗，量多;食積感染組小鼠活動(dòng)減少，扎堆，蜷縮，眼睛分泌物多，睜眼受限，毛色發(fā)黃結(jié)成束狀，較臟，糞便呈黃棕色、質(zhì)細(xì)，量較少，較硬。

2.2 血清IgM含量、IFN－γ、IL－4、TH1/TH2水平

2.2.1 小鼠血清IgM 結(jié)果顯示，小鼠感染FM1病毒后第1、3天，單純感染組較正常組小鼠血清IgM升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);食積感染組較正常組IgM水平升高，但結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);食積感染組水平較單純感染組降低，但結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。小鼠感染FM1病毒后第5天，單純感染組、食積感染組小鼠均較正常組小鼠血清IgM含量下降，且食積感染組結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，食積感染組較單純感染組、正常組小鼠血清IgM含量明顯降低，且結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 小鼠血清IgM(μg/mL) (±s)

表1 小鼠血清IgM(μg/mL) (±s)

注:與同天正常組相比，*P＜0.01;與同天單純感染組相比，△△P＜0.01。

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2.2.2 細(xì)胞因子水平

2.2.2.1 小鼠血清IL－4變化 小鼠感染FM1病毒后第1、3、5天，單純感染組、食積感染組小鼠血清IL－4水平均較正常組升高，且食積感染組結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，單純感染組與正常組比較第3天結(jié)果差異顯著(P＞0.05)，食積感染組小鼠較單純感染組升高，且在第1、5天時(shí)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)表2。

表2 小鼠血清IL－4(pg/mL)(±s)

表2 小鼠血清IL－4(pg/mL)(±s)

注:與同天正常組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與同天單純感染組相比，△△P ＜0.01。

10 10 10正常組 202.260±35.6481 203.907±29.1355 225.121±39.0966單純感染組 203.640±28.9521 240.159±36.4371* 226.438±54.7801食積感染組244.844±22.3894＊＊△△ 249.052±49.2737＊＊ 367.107±59.7842 1 d 3 d 5 d鼠數(shù)時(shí)間＊＊△△

2.2.2.2 小鼠血清IFN－γ變化 小鼠感染FM1病毒后第1天，單純感染組、食積感染組小鼠血清IFN－γ均較正常組升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);于感染后第3、5天，單純感染組及食積感染組均較正常組下降，且在第5天下降明顯差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，食積感染組較單純感染組下降更為明顯，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 小鼠血清IFN－γ(pg/mL)(±s)

表3 小鼠血清IFN－γ(pg/mL)(±s)

注:與同天正常組相比，＊＊P＜0.01。

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2.2.2.3 小鼠血清TH1/TH2變化 小鼠感染FM1病毒后第1、3、5天，單純感染組、食積感染組均較正常組降低，且在第3天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而在第3、5天食積感染組較正常組降低更為明顯，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);食積感染組在不同時(shí)相雖均較單純感染組下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表4。

表4 小鼠血清TH1/TH2(±s)

表4 小鼠血清TH1/TH2(±s)

注:與同天正常組相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01。

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3 討論

基于小兒特殊的生理病理特點(diǎn)，使得小兒易發(fā)生食積，并表現(xiàn)出病理狀態(tài)，從而引發(fā)各種相關(guān)疾病。已有研究證實(shí)，食積可導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素血癥及肺損傷等[4]，隨著食積實(shí)驗(yàn)研究不斷深入，食積不僅對(duì)血生化、胃腸功能的改變產(chǎn)生了影響，而且對(duì)免疫功能也有作用。畢可恩等通過(guò)對(duì)食積狀態(tài)下小鼠免疫功能的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，非特異性免疫的巨噬細(xì)胞吞噬功能、細(xì)胞免疫的遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、體液免疫的血清溶血素測(cè)定等免疫指標(biāo)，食積組明顯低于正常組，推測(cè)免疫功能的改變可能是食積患兒易于反復(fù)感染外邪的內(nèi)在病理基礎(chǔ)[5]。流感病毒經(jīng)由呼吸道侵入機(jī)體后不僅能在呼吸道的細(xì)胞內(nèi)增殖，導(dǎo)致呼吸道各類細(xì)胞變性、壞死，病毒顆粒尚可穿過(guò)呼吸道黏膜，引起進(jìn)行性感染，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及多核細(xì)胞生長(zhǎng)特性改變、功能降低甚至溶解、凋亡，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低[6]。病毒可激活小鼠的免疫細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基、NO和大量細(xì)胞因子，而這些因子作為免疫介質(zhì)介導(dǎo)的全身病理反應(yīng)導(dǎo)致小鼠發(fā)病[7]，并造成免疫器官損傷和功能下降。免疫球蛋白是具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)上與抗體相似的球蛋白，是一類重要的免疫效應(yīng)分子，經(jīng)抗原誘導(dǎo)可轉(zhuǎn)化為抗體，IgM就是其中的一種，其主要參與機(jī)體的體液免疫調(diào)節(jié)，主要作用是與抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，生成抗原－抗體復(fù)合物，從而阻斷病原體對(duì)機(jī)體的危害。機(jī)體在病毒、細(xì)菌等感染后，抗原刺激誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答過(guò)程中，IgM產(chǎn)生時(shí)間最早，血清中以IgM為代表，形成對(duì)付外源性微生物或病毒侵入的第一道防線[8]。本實(shí)驗(yàn)中，在小鼠感染FM1病毒后第5天，血清IgM含量食積感染組較正常組及單純感染組均下降，說(shuō)明食積小鼠感染FM1病毒感染后，機(jī)體體液免疫能力明顯下降，這與黎交清等[9]報(bào)道的小兒感染的IgM指標(biāo)有所下降是一致的。而單純感染組小鼠IgM水平較正常組降低，這與國(guó)內(nèi)報(bào)道也是一致的[10－11]。小鼠在感染FM1病毒后第1、3天，單純感染組及食積感染組小鼠血清IgM含量均較正常組升高，可能與淋巴細(xì)胞迅速增殖，從而產(chǎn)生較多的IgM積極參與機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，阻斷病毒對(duì)機(jī)體的危害有關(guān)。而食積感染組小鼠血清IgM水平較單純感染組下降明顯，可能與陽(yáng)明積熱本身已經(jīng)對(duì)機(jī)體的體液免疫能力產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致機(jī)體的抗感染能力下降，一旦受到病毒的侵襲后，導(dǎo)致機(jī)體IgM濃度出現(xiàn)明顯降低，進(jìn)一步影響機(jī)體免疫能力及抗感染能力，這與報(bào)道的感染期間的細(xì)胞免疫功能和補(bǔ)體系統(tǒng)功能相對(duì)減弱，機(jī)體抗感染能力隨之下降也是一致的[12]，食積通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體體液免疫影響了機(jī)體IgM的含量，從而導(dǎo)致機(jī)體抗感染能力下降。

干擾素(IFN)是一種廣泛的抗病毒物質(zhì)，是機(jī)體抗病毒感染中最重要的細(xì)胞因子之一，在病毒性疾病的康復(fù)中有重要地位[13]。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染小鼠后，模型組IFN－γ水平較正常組明顯降低，說(shuō)明流感病毒感染導(dǎo)致機(jī)體的細(xì)胞免疫功能減弱，對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生了抑制作用。流感病毒經(jīng)抗原遞呈后活化CD4+T細(xì)胞，活化的CD4+Th細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，可分化為Th1，Th2兩個(gè)亞類，正常狀態(tài)下，TH1/TH2通過(guò)分泌細(xì)胞因子彼此調(diào)節(jié)，相互制約，相對(duì)平衡，以維持正常免疫狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中，病毒感染后，小鼠血清IFN－γ/IL－4水平，單純感染組、食積感染組均較正常組下降，尤其在病毒感染后的第3、5天降低較為明顯，食積感染組降低更為明顯，食積感染組小鼠TH1/TH2水平較正常組及單純感染組降低，說(shuō)明病毒感染引起了機(jī)體抗炎與促炎水平的失衡，從而導(dǎo)致了機(jī)體免疫功能的紊亂，且食積感染組對(duì)機(jī)體免疫失衡的影響更為明顯。食積感染組較單純感染組小鼠血清IFN－γ/IL－4水平有下降趨勢(shì)，但其對(duì)機(jī)體免疫失衡的影響是否更為嚴(yán)重仍需進(jìn)一步論證。因此，食積因素可能通過(guò)影響機(jī)體IgM產(chǎn)生、IFN－γ、IL－4細(xì)胞因子水平，導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生失調(diào)，從而對(duì)機(jī)體免疫功能產(chǎn)生了影響，說(shuō)明食積可能與對(duì)肺熱證的發(fā)生、發(fā)展存在一定相關(guān)性。因此，食積因素可能通過(guò)影響小兒機(jī)體免疫功能，從而使小兒易于發(fā)生呼吸系統(tǒng)感染，本研究提示及時(shí)消除食積內(nèi)因，對(duì)于呼吸系統(tǒng)感染性疾病易感人群可以起到防護(hù)的目的。

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