解放軍第309醫(yī)院急救部（北京100091） 王天昊 樊雙義 閆 潔 陳 遠(yuǎn) 馬朋林

由于對覺醒系統(tǒng)認(rèn)識的不充分，昏迷的促醒研究也無重大進(jìn)展。1998年覺醒肽（Orexins）的發(fā)現(xiàn)使人們對睡眠、覺醒的認(rèn)識進(jìn)入新的階段，也為昏迷的治療提供廣闊的前景。研究發(fā)現(xiàn)［1-2］分泌Orexins的神經(jīng)元僅位于下丘腦外側(cè)區(qū)（LHA），但其神經(jīng)纖維卻可投射到網(wǎng)狀上行激動系統(tǒng)的廣泛區(qū)域，如5-羥色胺能的中背縫核（DR）、組胺能的乳頭體核（TMN）、去甲腎上腺素能的藍(lán)斑（LC）等，因此，Sakurai等［3］推測 Orexins可能作用于5-羥色胺能等神經(jīng)系統(tǒng)，促進(jìn)5-羥色胺、組胺、去甲腎上腺素的釋放從而促進(jìn)睡眠的覺醒并實(shí)驗(yàn)證實(shí)。Orexins可促進(jìn)睡眠覺醒，但是否可促醒昏迷。酒精性昏迷是臨床上常見的昏迷類型，賈曉軍［4］的前期研究證實(shí)，腦室注射Orexin-A可對酒精性昏迷起到促醒作用。然而，其促醒機(jī)制是否與5-羥色胺素能等神經(jīng)系統(tǒng)的激活相關(guān)尚無定論。本實(shí)驗(yàn)擬通過向酒精性昏迷大鼠模型腦室內(nèi)注入特異性5-羥色胺（5-HT2）受體阻斷劑，以翻正反射持續(xù)時間（LORR）和大鼠皮層腦電δ波為評價指標(biāo)，探討Orexin-A對酒精性昏迷促醒作用是否與5-羥色胺系統(tǒng)相關(guān)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 本研究選取健康成年雌性SD大鼠24只（由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供），平均體重200±30g。按隨機(jī)數(shù)排序分組法，將大鼠分為對照組（人工腦脊液，ACSF）、覺醒肽組（Orexin-A）、阻斷劑組（5-羥色胺受體阻斷劑利坦色林，Ritanserin）及阻斷劑+覺醒肽組（Ritanserin+Orexin-A）4組。

2 主要溶液的配置 人工腦脊液（ACSF）的配制：ACSF中各種離子成份及其濃度（mM）：NaCl 126，KCl 2.5，CaCl22，MgCl22，NaH2PO41.25，NaHCO326，葡萄糖10。Orexin-A溶液的配制：用ACSF溶解配制成 Orexin-A溶液：4nmol／5μl、4nmol／10μl。配制劑量參考以往文獻(xiàn)［5-6］。32%酒精溶液的配制：取無水乙醇以生理鹽水稀釋配制成32%的酒精溶液。Ritanserin溶液的配制：用新鮮ACSF配制，所配濃度分別為：Ritanserin40μg／5μl、40μg／10μl。

3 酒精昏迷模型建立及意識狀態(tài)分級 參照Yacoubi、賈曉軍等建立酒精性昏迷模型［4，7］。腹腔注射32%酒精溶液（14ml／kg），將大鼠的意識狀態(tài)分為6級：Ⅰ級：在籠內(nèi)活動如常；Ⅱ級：在籠內(nèi)活動減少；Ⅲ級：在籠內(nèi)活動減少并運(yùn)動失調(diào)；Ⅳ級：當(dāng)背部放在籠的底部時能滾動（翻正反射存在）但不能站立；Ⅴ級：翻正反射消失（Loss of righting reflex，LORR）但對疼痛刺激有肢體回縮反應(yīng)；Ⅵ級：對任何刺激無反應(yīng)。其中Ⅴ、Ⅵ級被認(rèn)為是昏迷狀態(tài)［8］。本實(shí)驗(yàn)中，我們以LORR作為昏迷的判別標(biāo)準(zhǔn)。

4 安放腦電皮層電極及側(cè)腦室套管 腹腔注射4%戊巴比妥鈉（30mg／kg）麻醉大鼠后，安裝頭部電極和側(cè)腦室金屬套管，額葉電極：前囟前2mm，中線左旁開2mm；雙頂葉電極：中線左、右旁開4mm，前囟后6mm，深度（約0.7～1.0mm）觸及硬腦膜。埋置側(cè)腦室金屬套管參照Paxinos-Watson圖譜，中線旁1.5mm，前囟后1.5mm，深度3.0mm，自制套管直徑0.8mm。電極安放后，大鼠飼養(yǎng)2周。進(jìn)行皮層腦電圖記錄時，將腦皮層電極導(dǎo)線連接到RM6240生理信號采集處理系統(tǒng)。記錄腦電圖，以δ波所占腦電波比例多少作為昏迷深度的判別指標(biāo)。隨著昏迷深度增加，δ波所占腦電波的百分比增加。將給藥前δ波所占的百分比標(biāo)準(zhǔn)化為1，根據(jù)δ波百分比變化判斷給藥是否加深或減輕昏迷。

5 給藥方式 大鼠翻正反射消失后，各組均通過側(cè)腦室埋置的金屬套管微注射實(shí)驗(yàn)藥物。對照組腦室注入 ACSF10μl；Orexin-A 組腦室注入 Orexin-A10μl（4nmol／10μl）；阻斷劑組腦室注入 Ritanserin 40μg／10μl；阻斷劑+Orexin-A組腦室注入Ritanserin 40μg／5μl后注入 Orexin-A5μl（4nmol／5μl）。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間不同時間點(diǎn)比較采用重復(fù)測量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 側(cè)腦室不同給藥對酒精性昏迷大鼠LORR持續(xù)時間的影響 同對照組相比，給Orexin-A后LORR持續(xù)時間明顯縮短（2.90±0.30、1.85±0.35，P＜0.01）；而給5-羥色胺（5-HT2）受體阻斷劑利坦色林后，LORR持續(xù)時間明顯延長（2.90±0.30、4.47±0.49，P＜0.01）；在預(yù)先給予利坦色林處理然后再給Orexin-A，與對照組相比，LORR持續(xù)時間無明顯縮短（2.90±0.30、3.11±0.48，P＞0.05），與 Orexin-A組比較LORR持續(xù)時間則明顯延長（P＜0.01）。見圖1。

側(cè)腦室不同給藥對酒精昏迷大鼠LORR持續(xù)時間影響

2 側(cè)腦室給藥后不同時間對酒精性昏迷大鼠ECoG中δ波比例的影響 對照組（人工腦脊液）隨著給藥時間延長，δ波相對百分比逐漸下降；同對照組相比，給Orexin-A后大鼠δ波相對百分比下降速率顯著加快（P＜0.01）；給予利坦色林組大鼠，5min后δ波相對百分比卻明顯升高（96.46±6.55、118.89±7.60，P＜0.01）；此外，先給利坦色林預(yù)處理然后再給Orexin-A，δ波相對百分比與對照組相比無明顯差異（P＞0.05），但與Orexin-A組比較差異顯著（P＜0.01）。見圖2。

圖2 側(cè)腦室給藥后不同時間對酒精昏迷大鼠ECoG中δ波比例的影響

討 論

昏迷的促醒治療具有重要的臨床意義?；杳允怯X醒系統(tǒng)結(jié)構(gòu)受損或功能受抑所致［9］。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，覺醒系統(tǒng)即是指腦干上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)。Orexins的發(fā)現(xiàn)是一個里程碑。目前觀點(diǎn)認(rèn)為，下丘腦外側(cè)區(qū)的覺醒肽Orexins直接調(diào)節(jié)和影響著上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)的功能，被稱為機(jī)體的“覺醒啟動區(qū)”［9-10］。是調(diào)節(jié)睡眠和覺醒的關(guān)鍵神經(jīng)元。賈曉軍研究發(fā)現(xiàn)其不僅可調(diào)節(jié)睡眠覺醒，還可對昏迷起促醒作用。本研究進(jìn)一步探討其促醒機(jī)制。

5-羥色胺是傳統(tǒng)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。5-羥色胺能神經(jīng)元主要存在于低位腦干，其中中背縫核內(nèi)（DR）是5-HT相對集中區(qū)。中背縫核同時也是重要的覺醒區(qū)域。Sakai等［11］運(yùn)用在體單細(xì)胞神經(jīng)元放電記錄方法研究發(fā)現(xiàn)覺醒期間5-HT能神經(jīng)元放電活躍，而在慢波睡眠（SWS）期開始減少；Portas等［12］運(yùn)用微量滲透方法研究發(fā)現(xiàn)腦中5-HT及其代謝產(chǎn)物含量在清醒期明顯升高。并發(fā)現(xiàn)5-HT與睡眠有著密切的關(guān)系，覺醒時5-HT系統(tǒng)激活，功能增高，睡眠時5-HT能系統(tǒng)功能降低，快眼動（REM）睡眠時最低。上述結(jié)果均提示5-HT與覺醒有關(guān)。Orexins神經(jīng)元僅分布于下丘腦外側(cè)區(qū)（LHA），但Orexins神經(jīng)元纖維投射到上行激動系統(tǒng)的廣泛區(qū)域，既往人們已認(rèn)識到睡眠和覺醒之間的轉(zhuǎn)換是由單胺能（組胺，5-羥色胺，去甲腎上腺素）等興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和腺苷、P物質(zhì)、GABA能抑制性神經(jīng)遞質(zhì)等相互作用調(diào)節(jié)，但他們受何精確調(diào)節(jié)而實(shí)現(xiàn)睡眠和覺醒的轉(zhuǎn)換無法認(rèn)知。Orexins的發(fā)現(xiàn)使人們認(rèn)識到它的覺醒調(diào)節(jié)啟動作用，以及這些遞質(zhì)與Orexins的關(guān)系。

近期研究發(fā)現(xiàn)Orexins的覺醒機(jī)制與傳統(tǒng)的興奮性單胺能神經(jīng)遞質(zhì)（5-羥色胺、組胺、5-HT）相關(guān)［3］。Wang等［13］通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，背縫核的5-羥色胺能神經(jīng)元活性受到Orexins系統(tǒng)的支配，Orexin-A通過Orexin-1受體對5-羥色胺能神經(jīng)元起到調(diào)節(jié)作用。最近有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)［14］，Orexin-A對麻醉大鼠具有促醒效應(yīng)，這主要是通過5-羥色胺能神經(jīng)元在快眼動睡眠及慢波睡眠期作用放電頻率增加實(shí)現(xiàn)的。上述研究結(jié)果證明Orexins對覺醒的促醒作用機(jī)制與5-羥色胺能系統(tǒng)有關(guān)。然而，Orexins對酒精性昏迷——這一臨床常見昏迷的促醒機(jī)制是否也與興奮單胺能神經(jīng)系統(tǒng)（如5-羥色胺）相關(guān)？本研究針對這一問題進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)論證。實(shí)驗(yàn)運(yùn)用兩種經(jīng)典的監(jiān)測手段——翻正反射消失（LORR）持續(xù)時間和皮層腦電圖來評判實(shí)驗(yàn)大鼠的意識狀態(tài)［14］。其中，皮層腦電圖可連續(xù)監(jiān)測皮層腦電活動狀況，且振幅比頭皮腦電圖大10倍，靈敏度高?；杳詴r皮層腦區(qū)電活動頻率減慢、δ波所占比例明顯增加。采用向側(cè)腦室內(nèi)給予5-羥色胺（5-HT2）受體阻斷劑利坦色林阻斷5-羥色胺能系統(tǒng)的激活，觀察對Orexin-A逆轉(zhuǎn)酒精性昏迷作用的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與給予Orexin-A的促醒作用相反，給予5-羥色胺（5-HT2）受體阻斷劑利坦色林組大鼠，與對照組（人工腦脊液）比較，5min后δ波相對百分比明顯升高，并持續(xù)30min以上（圖2），LORR持續(xù)時間亦顯著延長（圖1），提示阻斷5-羥色胺遞質(zhì)的作用可顯著加深昏迷的程度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，先給予利坦色林預(yù)處理然后再給Orexin-A，與對照組相比，δ波比例并沒有因Orexin-A而降低，LORR持續(xù)時間亦并沒有因Orexin-A的興奮性作用而縮短，Orexin-A的興奮作用被利坦色林阻斷。此結(jié)果提示5-羥色胺能系統(tǒng)的激活是Orexin-A對酒精性昏迷大鼠促醒的重要作用機(jī)制之一。

綜上，Orexin-A對酒精性昏迷大鼠有良好的促醒作用。其促醒作用機(jī)制，與5-羥色胺能系統(tǒng)的激活相關(guān)，為臨床昏迷的促醒研究及促醒藥物研制等提供了新線索。

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