Chiara Azzari 教授

姚開虎 副研究員

姚開虎副研究員 非常高興邀請到意大利佛羅倫薩大學(xué)附屬Anna Meyer兒童醫(yī)院Chiara Azzari教授來北京兒童醫(yī)院做學(xué)術(shù)訪問，在您的“侵襲性細(xì)菌感染的分子學(xué)診斷:一個有用的臨床工具”的報告中談到采用分子診斷方法評估意大利肺炎鏈球菌疾病負(fù)擔(dān)的工作，這些經(jīng)驗對中國開展相關(guān)工作具有很好的借鑒意義。分子生物學(xué)方法有很多，各有優(yōu)缺點。在北京兒童醫(yī)院的有關(guān)研究項目中，使用多重PCR和核酸雜交的方法比較多。

Azzari教授 目前臨床上細(xì)菌感染診斷能采用的最好的分子生物學(xué)方法還是RT-PCR，其特異度可達(dá)到100%，敏感度也很高。和細(xì)菌培養(yǎng)方法比較，敏感度可達(dá)98%，即100份培養(yǎng)陽性的標(biāo)本用RT-PCR檢測98%陽性;但100份RT-PCR陽性標(biāo)本的培養(yǎng)陽性率只有50%，甚至更低。所以，認(rèn)為“和培養(yǎng)方法比較，RT-PCR方法敏感度為98%”是不確切的，更為準(zhǔn)確的說法是:RT-PCR方法遠(yuǎn)比培養(yǎng)方法敏感。

很多研究者認(rèn)為細(xì)菌培養(yǎng)方法已經(jīng)不適于作為標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)該考慮使用RT-PCR作為診斷細(xì)菌感染的標(biāo)準(zhǔn)方法。美國CDC在世界各地指導(dǎo)實驗室工作時均推薦使用RTPCR。

Anna Meyer兒童醫(yī)院發(fā)表在PloS One的多中心研究表明，RT-PCR檢測病毒和細(xì)菌較普通PCR更為敏感。此后，又與澳大利亞、加拿大、美國和歐洲的實驗室進(jìn)行了多中心盲法檢測肺炎鏈球菌血清型的比較研究，澳大利亞的實驗室準(zhǔn)備了不同數(shù)量的主要和次要血清型的肺炎鏈球菌標(biāo)本，其他實驗室或選擇細(xì)菌培養(yǎng)方法，或選擇普通PCR方法，我們實驗室選擇了RT-PCR方法對樣本直接檢測，敏感度之高讓澳大利亞實驗室難以置信，要求再進(jìn)行RT-PCR、培養(yǎng)+RT-PCR同時檢測，結(jié)果RT-PCR對主要血清型肺炎鏈球菌檢測的敏感度達(dá)到100%，但對次要血清型檢測的敏感度稍低一些，培養(yǎng)+RT-PCR的敏感度不論對主要還是次要血清型都接近100%。RT-PCR對次要血清型檢測的敏感度較低可能與沒有檢測所有已知的血清型有關(guān)，但就常規(guī)檢測來說已經(jīng)足夠。

姚開虎副研究員 細(xì)菌感染的其他實驗室檢測方法的結(jié)果如何?

Azzari教授 培養(yǎng)+基因芯片的檢測方法也取得了很好的結(jié)果?；蛐酒瑥臉?biāo)本中直接檢測的結(jié)果對肺炎鏈球菌主要血清型檢測的敏感度尚可，但對次要血清型的檢測陽性率很低(約20%)。因為當(dāng)時基因芯片方法檢測血清型要基于細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果，如果培養(yǎng)結(jié)果陰性，基因芯片方法的結(jié)果也比較差。

姚開虎副研究員 北京兒童醫(yī)院對呼吸道標(biāo)本采用多重PCR結(jié)合反向線點雜交方法(mPCR/RLB)，敏感度和特異度都很高。針對死亡病例肺組織標(biāo)本，原位 PCR(IS-PCR)和核酸雜交的檢測陽性率水平接近。通過實時熒光定量PCR鑒定細(xì)菌時，由于定量PCR擴增的循環(huán)數(shù)與結(jié)果的判斷關(guān)系很大，在Anna Meyer兒童醫(yī)院實驗室區(qū)分陰性和陽性結(jié)果選擇的合適循環(huán)數(shù)是多少?

Azzari教授 我們根據(jù)多次實驗結(jié)果總結(jié)出在40個循環(huán)比較合適。

姚開虎副研究員 PCR方法陽性率都很高，短期內(nèi)控制檢測質(zhì)量較為容易，但長期控制實驗質(zhì)量比較困難。在長期研究中發(fā)現(xiàn)，更換檢測試劑產(chǎn)品、產(chǎn)品批次和重新合成引物等都有可能影響到實驗結(jié)果。有時候很難確定問題出在哪些環(huán)節(jié)，需要再次使用陽性標(biāo)本等反復(fù)試驗。獲得一個穩(wěn)定的檢測體系和方案，常需提前安排一些質(zhì)量控制工作，以保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

Azzari教授 試劑更換過程中，較容易出現(xiàn)問題的是引物，必須經(jīng)常使用陽性對照檢測引物，每1～2個月就應(yīng)該對檢測的所有血清型做陽性對照檢測，以確認(rèn)引物有效，這個工作非常重要。針對肺炎鏈球菌要同時檢測自溶酶基因lytA，如果lytA陽性說明有肺炎鏈球菌感染，而如果血清型的檢測均為陰性，說明檢測血清型的引物可能有問題，或者是其他少見或新的血清型，需要增加特異引物。遇到這樣的結(jié)果，可能需要考慮對莢膜位點基因進(jìn)行測序，從序列信息很容易確定血清型，但價格昂貴不能常規(guī)開展。

姚開虎副研究員 RT-PCR檢測時間也比細(xì)菌培養(yǎng)方法縮短，臨床能及時得到回饋信息，有利于醫(yī)生及時修訂治療方案。對于細(xì)菌耐藥嚴(yán)重情況，及時反饋的信息對控制抗生素使用非常有好處。

Azzari教授 在意大利，明確腦膜炎病原是肺炎鏈球菌后，會選用頭孢噻肟或頭孢噻肟+萬古霉素治療，或者萬古霉素治療后不見好轉(zhuǎn)再加用頭孢噻肟。如果腦膜炎的病原中檢測到腦膜炎雙球菌，青霉素和磺胺類藥物均有效，只需要選用一種即可。這些都對控制抗生素耐藥有積極意義。從公共健康角度意義更重大，如明確是b型流感嗜血桿菌(Hib)或腦膜炎雙球菌的感染，就應(yīng)開始對接觸者行預(yù)防性治療。明確本地區(qū)現(xiàn)在肺炎鏈球菌感染的血清型就可以考慮針對性使用疫苗，19A型在意大利已經(jīng)相當(dāng)流行，7價、10價疫苗都不適用，應(yīng)該選用包含19A型的13價結(jié)合疫苗。

姚開虎副研究員 中國的研究結(jié)果也顯示在華北(北京、天津)和東北(沈陽)的一些城市肺炎鏈球菌19A型已經(jīng)流行，甚至是第一常見的血清型，也應(yīng)該考慮使用13價結(jié)合疫苗。

病原檢測應(yīng)該要求臨床醫(yī)生對送檢標(biāo)本、送檢項目要有清楚的認(rèn)識，不輕易的去做大范圍的檢測。

Azzari教授 這一點非常重要。RT-PCR受檢測引物的決定，從臨床角度來說檢測所有細(xì)菌和病毒不現(xiàn)實。免疫缺陷患者懷疑HIV感染時，檢測的應(yīng)是HIV，不應(yīng)包含HCV或者HBV。意大利化膿性腦膜炎90%的病原菌為肺炎鏈球菌、腦膜炎雙球菌和流感嗜血桿菌，臨床懷疑化膿性腦膜炎時應(yīng)首先檢測這3種病原菌，如果結(jié)果陰性再檢測葡萄球菌等其他病原，這樣能有效節(jié)約資源。再如肺炎鏈球菌和肺炎支原體是肺炎最常見的病原，如果醫(yī)生發(fā)現(xiàn)病例有肺壞死的表現(xiàn)，考慮可能是少見的金黃色葡萄球菌感染，此時臨床醫(yī)生可以要求實驗室對可檢測的所有肺炎病原進(jìn)行檢測，但對腦膜炎球菌等病原仍然沒有檢測必要。對于病毒病原，思維程序也是相似的。

Anna Meyer兒童醫(yī)院有一個病原檢測分組(panels)的概念，檢驗科醫(yī)生與臨床醫(yī)生共同討論決定不同疾病的檢測項目，如社區(qū)獲得性肺炎和ICU肺炎的病原檢測項目是不同的。ICU肺炎的病原中有腸球菌、大腸埃希菌等，但在社區(qū)獲得性肺炎就不做上述細(xì)菌檢測。不同病原檢測仍為陰性時，會針對16S rDNA進(jìn)行測序，該基因存在于所有細(xì)菌，因為不是很特異，這項工作不能采用RT-PCR。

臨床醫(yī)生應(yīng)指導(dǎo)實驗室確定檢測的方向。百日咳桿菌不應(yīng)該存在于咽喉部，如果檢測結(jié)果陽性，就是異常。但很多病毒、細(xì)菌可以在咽喉部正常存在，也可能致病。咽喉部檢測到肺炎鏈球菌，可能是肺炎病原，也可能就是寄生菌，不能以這個結(jié)果進(jìn)行判斷。小嬰兒攜帶腦膜炎球菌的情況也很少見，如果在咽拭子中檢測到奈瑟氏球菌，就應(yīng)考慮流行性腦膜炎。重要的是臨床醫(yī)生要知道在什么部位能發(fā)現(xiàn)什么，不能發(fā)現(xiàn)什么，并根據(jù)臨床情況確定采集標(biāo)本的種類和檢測病原方向。

姚開虎副研究員 采集標(biāo)本的時機和方法都會影響檢測結(jié)果。對于分子生物學(xué)方法檢測，病原菌標(biāo)本的采集您能給出一些什么建議。

Azzari教授 應(yīng)盡可能早地采集標(biāo)本，第一份標(biāo)本中檢出病原的可能性大。就RT-PCR檢測，標(biāo)本保存1～2d不會影響結(jié)果。最好采集無菌體液標(biāo)本，如果發(fā)現(xiàn)病原就意味著該病原的感染。在無菌標(biāo)本中沒有發(fā)現(xiàn)病原，可以考慮使用拭子標(biāo)本，但要明確目的是什么。比如咽拭子標(biāo)本檢測是否百日咳桿菌感染是可行的，要判斷是否肺炎鏈球菌感染則不可行。臨床醫(yī)生遇到長期發(fā)熱的患兒，想檢測腺病毒感染，以區(qū)別川崎病，如果送檢血標(biāo)本檢測出了腺病毒，可以肯定腺病毒感染;但如果是咽拭子標(biāo)本，則不能肯定，因為腺病毒可以在感染后持續(xù)存在數(shù)月。

姚開虎副研究員 盡可能早的采集標(biāo)本對細(xì)菌培養(yǎng)檢測也很重要，但同時需要強調(diào)及時送檢，放置過久對結(jié)果影響很大。常規(guī)培養(yǎng)常推薦在患兒發(fā)熱時采集血標(biāo)本，而mPCR/RLB檢測的標(biāo)本并沒有提出這樣的要求，但檢測標(biāo)本常常是在采集血培養(yǎng)時留取的標(biāo)本，檢測的敏感度和特異度還是相當(dāng)高。

Azzari教授 發(fā)熱時采集血標(biāo)本對RT-PCR檢測病原可能也是最好的時間點，但并沒有發(fā)現(xiàn)采集標(biāo)本時機對結(jié)果有明顯影響。有一點必須考慮到，僅10%～15%的肺炎存在菌血癥。

姚開虎副研究員 在呼吸道感染病原菌的檢測中，假陽性的問題常被提及。已經(jīng)證明肺炎鏈球菌很多特異的致病毒力因子基因，也存在于鼻咽部或口腔攜帶的緩癥鏈球菌、口腔鏈球菌等菌株中。也有文獻(xiàn)報道肺炎鏈球菌攜帶者尿抗原檢測陽性。目前有研究證明在臨床標(biāo)本中檢測某些基因，包括lytA、ply等可用于肺炎鏈球菌的診斷，多數(shù)研究結(jié)果顯示其具有較高的敏感度和特異度。

Azzari教授 要確認(rèn)從血標(biāo)本中檢測出肺炎鏈球菌NA意味著感染，而不是攜帶。肺炎鏈球菌攜帶者尿抗原檢測陽性率為50%，這個結(jié)果像是擲硬幣。Anna Meyer兒童醫(yī)院不采用尿抗原檢測方法。但是血標(biāo)本的檢測結(jié)果有所不同，J Med Microbiol在2011年發(fā)表的一項研究結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌的攜帶者血標(biāo)本中肺炎鏈球菌RT-PCR檢測不會呈陽性;如陽性就意味著肺炎鏈球菌感染。這篇文章刊出后2個月，美國CDC發(fā)表在Diagn Microbiol Infect is上研究也證實了這一結(jié)論。這2項研究很好的說明了T-PCR方法的特異度。這一結(jié)論不同于1998年發(fā)表在Clin Microbiol一項研究的結(jié)論，其認(rèn)為肺炎患者和健康對照者或攜帶和非攜帶肺炎鏈球菌者均可能出現(xiàn)陽性結(jié)果。出現(xiàn)差異性的結(jié)論源于1998年的研究，采用的是普通CR，特異度比較差，檢測的是肺炎鏈球菌溶血素基因ply，而非當(dāng)前檢測的lytA。

姚開虎副研究員 您是否認(rèn)為采用RT-PCR檢測方法在診斷肺炎鏈球菌感染及其血清型方面非常優(yōu)秀?

Azzari教授 是的，采用RT-PCR檢測方法得到的肺炎鏈球菌陽性結(jié)果是不用懷疑的。

姚開虎副研究員 臨床很關(guān)注細(xì)菌耐藥。細(xì)菌感染使用抗生素，藥物敏感性的檢測具有重要的指導(dǎo)價值，但是細(xì)菌培養(yǎng)陽性率很低。您對目前分子生物學(xué)方法檢測耐藥基因、耐藥突變位點的研究如何評價。

Azzari教授 分子生物學(xué)方法來檢測細(xì)菌耐藥性與細(xì)菌培養(yǎng)藥物敏感性檢測結(jié)果之間并非一致，有條件應(yīng)進(jìn)行藥物敏感性檢測。在Anna Meyer兒童醫(yī)院同時留取2份標(biāo)本，一份標(biāo)本送培養(yǎng)，一份行RT-PCR檢測。RT-PCR給出陽性結(jié)果時，如果培養(yǎng)也陽性，就可以進(jìn)行藥物敏感性檢測;如果培養(yǎng)陰性，會行耐藥性的分子生物學(xué)檢測。Anna Meyer兒童醫(yī)院的醫(yī)生不愿意送檢胸腔積液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，因為從來沒有得到過陽性結(jié)果，實際上可以停止這樣的檢查。但對腦脊液來說，還是可以進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，還是會有陽性結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些陽性結(jié)果可以很好的用于評估藥物敏感性。

姚開虎副研究員 意大利細(xì)菌耐藥的情況如何?

Azzari教授 肺炎鏈球菌耐藥并不常見，主要是對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥，紅霉素耐藥率大約40%。

姚開虎副研究員 來自中國的研究普遍認(rèn)為，中國肺炎鏈球菌紅霉素耐藥率接近100%。

Azzari教授 在意大利，幾乎沒有對青霉素，尤其是對頭孢菌素耐藥的肺炎鏈球菌。發(fā)熱的兒童，在家從來不立即使用抗生素。使用抗生素前，至少觀察3～4d，如果4d后仍然發(fā)熱，病情較重，會考慮使用抗生素。如果有證據(jù)顯示是病毒感染，即使較長時間發(fā)熱也不會使用抗生素。

姚開虎副研究員 中國正在推行行政干預(yù)的嚴(yán)格控制臨床抗生素使用的規(guī)定，意大利是否也有相應(yīng)的規(guī)定?

Azzari教授 有，但并不是通過政府行政干預(yù)，而是通過科學(xué)組織制定的臨床指南。

姚開虎副研究員 是否使用一種藥物，是一個醫(yī)學(xué)科學(xué)問題。濫用抗生素問題應(yīng)該通過科學(xué)教育和引導(dǎo)來解決。在建議、指南和規(guī)范都沒有見到任何效果的情況下，由行政干預(yù)來修正和指導(dǎo)，臨床醫(yī)生應(yīng)該好好反省。

指南不能改變抗生素濫用的一個原因是醫(yī)生對自己的醫(yī)療行為(處方抗生素)可能引起的公共衛(wèi)生后果(細(xì)菌耐藥、耐藥菌感染和后抗生素時代)不太關(guān)心。

中國藥物和疫苗的管理是兩個不同系統(tǒng)，兒科醫(yī)生并不能開疫苗處方。絕大多數(shù)疫苗又都用于兒童，兒科醫(yī)生理應(yīng)對此予以關(guān)注。但實際情況是中國兒科醫(yī)生對此類公共衛(wèi)生問題缺少系統(tǒng)認(rèn)識，行動更少。

Azzari教授 每個兒科醫(yī)生應(yīng)當(dāng)明白自己是公共健康的一份子，不了解當(dāng)?shù)丶?xì)菌的情況，就不能回答公共健康問題。正如前面談到的意大利臨床醫(yī)生不調(diào)查肺炎鏈球菌血清型，就不知道7價結(jié)合疫苗是否還適用。這樣的研究最好由臨床醫(yī)生來完成，這對政府決策將會是非常重要的信息。

姚開虎副研究員 謝謝Azzari教授精彩的學(xué)術(shù)報告和非常坦誠的交流。