劉艷紅 韓子明

腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎功能衰竭的共同途徑［1］。而腎臟疾病導(dǎo)致腎小管與間質(zhì)細(xì)胞的凋亡，影響腎臟重塑與修復(fù)，加重腎間質(zhì)纖維化［2］。有研究證實，在凋亡因素刺激下，發(fā)動蛋白-1(Drp-1)表達(dá)增加，線粒體持續(xù)分裂，引起相關(guān)凋亡因子表達(dá)水平改變及轉(zhuǎn)位，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3］。研究表明促紅細(xì)胞生成素(EPO)對多種器官都有保護作用，然而EPO對腎間質(zhì)纖維化Drp-1有無影響報道不多。本研究通過EPO干預(yù)腎間質(zhì)纖維化大鼠，觀察腎組織Drp-1的變化，探討EPO對腎間質(zhì)纖維化的保護機制。

1 方法

1.1 實驗動物和試劑81只健康13周齡雄性SD大鼠，體重180～230 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。EPO購自上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司，人抗大鼠Drp-1多克隆抗體購自圣克魯斯生物技術(shù)公司、SABC免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 分組、干預(yù)和取材 將大鼠均分為假手術(shù)組、對照組和EPO組，每組27只。對照組和EPO組采取左側(cè)輸尿管結(jié)扎并剪斷建立單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型［4］，假手術(shù)組僅游離輸尿管而不結(jié)扎和剪斷。EPO組于術(shù)后給予3 000 U·kg-1EPO皮下注射［5］;假手術(shù)組和對照組給予等量生理鹽水皮下注射。3組均于術(shù)后7、14、21d處死9只大鼠，心臟采血檢測SCr和BUN水平。并留取梗阻側(cè)腎臟標(biāo)本，置于10%甲醛溶液固定，石蠟切片3μm厚，用于蘇木精-伊紅、Masson和免疫組化染色。

1.3 腎臟組織病理 蘇木精-伊紅和Masson染色后在IDA-2000高清晰度數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)下分析。每張切片選取10個不重疊視野。Masson染色后測定腎間質(zhì)纖維化面積與同視野腎間質(zhì)總面積的百分比，取平均值作為每張切片的腎間質(zhì)纖維化相對面積。蘇木精-伊紅染色后對腎間質(zhì)損傷進行半定量評分，取其平均積分為每張切片評分，評分標(biāo)準(zhǔn):無病變?yōu)?分，＜25%為1分，～50%為2分，＞50%為3 分［6］。

1.4 免疫組化染色 用SABC法檢測腎組織中的Drp-1表達(dá)，操作步驟按試劑盒說明書進行。光鏡下組織切片呈棕黃色顆粒沉積區(qū)域為陽性染色部位，高倍鏡(×400)下在每張不包含腎小球和血管的腎間質(zhì)區(qū)域選取10個不重疊的視野，應(yīng)用IDA-2000高清晰度數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)進行圖像采集，經(jīng)灰度變換為陽性染色區(qū)域面積與該視野總面積百分比，計算平均值［7］。

表1 3組大鼠不同時點血肌酐和尿素氮水平比較±s)Tab 1 SCr and BUN levels atdifferent time points in three groups of rats( ± s)

表1 3組大鼠不同時點血肌酐和尿素氮水平比較±s)Tab 1 SCr and BUN levels atdifferent time points in three groups of rats( ± s)

Notes 1)vs sham group，(P＜0.05);2)vs control group，(P＜0.05)

Groups day 7 day 14day 21 SCr/μmol·L -1 Sham(n=9) 38±4 43±5 44±5 Control(n=9) 84±41) 108±61) 157±61)EPO(n=9) 60 ± 2.781，2) 74 ± 71，2) 113 ± 61，2)F 146.293 214.086 207.425 (P＜0.001) ＜0.001 ＜0.001 BUN/mmol·L-1 Sham(n=9) 5.7±0.1 6.0±0.4 6.3±0.1 Control(n=9) 8.6±0.31) 17.6±0.21) 24.6±1.41)EPO(n=9) 6.5 ± 1.31，2)12.0 ± 0.61，2)16.8 ± 0.51，2)F 79.264 113.489 161.731 (P＜0.001) ＜0.001＜0.001

2 結(jié)果

2.1 腎功能檢測結(jié)果 表1顯示，各時點對照組和EPO組SCr、BUN水平較假手術(shù)組顯著增高(P均＜0.01)，EPO組SCr和BUN水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義((P＜0.05))。

2.2 腎臟組織學(xué)改變 蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠術(shù)后各時點腎組織可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，腎小球、近端小管、遠(yuǎn)端小管的大小和形態(tài)正常，未見小管擴張及纖維增生等改變(圖1A～C)。對照組大鼠術(shù)后第7天可見腎小管上皮細(xì)胞胞漿疏松、腫脹空泡變性、間質(zhì)水腫，部分細(xì)胞嗜酸性變，并可見腎小管灶性萎縮、管腔輕度擴張，部分小管管腔內(nèi)見蛋白管型及上皮細(xì)胞管型，小管間質(zhì)稍增寬，其間可見成纖維細(xì)胞輕度增生及少量淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞局灶性浸潤(圖1D);術(shù)后第14天，腎小管上皮細(xì)胞腫脹空泡變性明顯，部分腎小管遭到嚴(yán)重破壞而消失，腎小管和集合管擴張成囊狀，小管間質(zhì)明顯增寬，間質(zhì)內(nèi)可見彌漫性巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，伴有較多成纖維細(xì)胞增生(圖1E);術(shù)后第21天，腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤稍減少，皮髓質(zhì)變薄，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性嚴(yán)重，大部分腎小管上皮細(xì)胞脫落壞死、萎縮和消失，殘余腎小管顯著擴張，間質(zhì)面積進一步增寬(圖1F)。EPO組各觀察時點病理改變較對照組明顯減輕(圖1G～I)。

表2顯示，EPO組各時點腎小管間質(zhì)損傷評分均低于對照組(P均＜0.05)，但高于假手術(shù)組((P＜0.05))。

Masson染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組各時點腎臟病理無明顯變化(圖2A～C)。對照組術(shù)后第7天可見腎間質(zhì)增寬，間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分增多，皮質(zhì)區(qū)和皮髓交界區(qū)出現(xiàn)纖維化(圖2D);術(shù)后第14天，皮質(zhì)區(qū)和皮髓交界區(qū)纖維化明顯(圖2E);術(shù)后第21天，腎間質(zhì)進一步增寬，間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分明顯增多，腎間質(zhì)纖維化程度較前明顯加重(圖2F);EPO組各時點腎組織病理改變較對照組減輕(圖2G～I)。

表2顯示，與對照組比較，EPO組各時點腎間質(zhì)纖維化相對面積明顯減小((P＜0.05))，但高于假手術(shù)組((P＜0.05))。

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果 假手術(shù)組各時點Drp-1微量表達(dá)于腎間質(zhì)和腎小管上皮細(xì)胞(圖3A～C)，對照組Drp-1表達(dá)位于腎小管上皮細(xì)胞胞漿及腎間質(zhì)，表達(dá)量隨梗阻時間延長逐漸升高(圖3D～F)。EPO組與對照組相比，表達(dá)部位基本一致，但范圍縮小，強度減弱(圖3G～H)。表2顯示，對照組和EPO組各時點Drp-1相對表達(dá)面積較假手術(shù)組顯著增加(P均＜0.05)，EPO組與對照組相比，表達(dá)顯著下降((P＜0.05))。

表2 3組大鼠不同時點腎小管間質(zhì)損傷評分、腎間質(zhì)纖維化相對面積和Drp-1相對表達(dá)面積比較(%±s)Tab 2 Renal interstitial injury score，renal interstitial fibrosis relative area and expression of Drp-1 relative area atdifferent time points of three groups of rats(% ±s)

表2 3組大鼠不同時點腎小管間質(zhì)損傷評分、腎間質(zhì)纖維化相對面積和Drp-1相對表達(dá)面積比較(%±s)Tab 2 Renal interstitial injury score，renal interstitial fibrosis relative area and expression of Drp-1 relative area atdifferent time points of three groups of rats(% ±s)

Notes 1)vs sham group，(P＜0.05);2)vs control group，(P＜0.05)

Groupsday 7day 14day 21 Renal interstitial injury score Sham(n=9) 0.49±0.03 0.51±0.07 0.52±0.04 Control(n=9) 3.4±0.21) 5.1±0.31) 6.4±0.31)EPO(n=9) 2.3 ± 0.21，2) 3.9 ± 0.21，2) 5.0 ± 0.31，2)F 46.274 103.655 116.937 (P＜0.001) ＜0.001 ＜0.001 Renal interstitial fibrosis relative area Sham(n=9) 1.6±0.09 1.7±0.1 1.9±0.2 Control(n=9) 14.4±0.61) 27.9±1.41) 53.2±2.41)EPO(n=9) 9.8 ± 0.61，2)17.4 ± 0.81，2)31.3 ± 1.91，2)F 85.033 126.572 187.836 (P＜0.001) ＜0.001 ＜0.001 Expression of Drp-1 relative area Sham(n=9) 0.9±0.09 1.0±0.1 1.1±0.2 Control(n=9) 9.9±0.41) 16.4±0.61) 25.7±0.21)EPO(n=9) 6.0 ± 0.21，2)11.3 ± 0.11，2)18.6 ± 0.21，2)F 153.628 428.371 507.845 (P＜0.001) ＜0.001＜0.001

2.4 Drp-1與腎間質(zhì)損傷的相關(guān)性 對照組和EPO組Drp-1相對表達(dá)面積與腎小管間質(zhì)損傷、腎間質(zhì)纖維化相對面積呈正相關(guān)(r分別為0.923和0.895，P均＜0.05)。

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是各種不同病因的慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎功能衰竭的共同途徑和最終結(jié)果，以腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)的過度積聚為病理特征［8］。有研究顯示，在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病中，腎小管上皮細(xì)胞的凋亡與腎小管的萎縮關(guān)系密切，成纖維細(xì)胞的增殖凋亡指數(shù)的增高是細(xì)胞外基質(zhì)形成的一個原因［9］。間質(zhì)纖維化程度與細(xì)胞凋亡數(shù)量呈正相關(guān)［10］。細(xì)胞凋亡的主要過程是線粒體斷裂。哺乳動物細(xì)胞中Drp-1是線粒體分裂的重要執(zhí)行分子。Drp-1主要位于細(xì)胞漿，并以多聚體的形式存在，當(dāng)受到線粒體外膜分子的招募可以轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，并且集中于線粒體潛在的分裂位點。多個Drp-1分子包圍線粒體最終致線粒體斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11，12］。本研究結(jié)果顯示，隨著梗阻時間的延長，對照組Drp-1表達(dá)量逐漸增加，Drp-1的表達(dá)量與腎間質(zhì)損傷評分、腎間質(zhì)纖維化相對面積呈正相關(guān)。提示Drp-1參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。

EPO是骨髓動員刺激因子，由腎臟和肝臟合成，是多功能細(xì)胞因子超家族成員。研究發(fā)現(xiàn)，EPO除能改善貧血的作用外，還有抑制炎癥反應(yīng)、促進血管生長、抑制細(xì)胞凋亡、減少細(xì)胞因子及炎癥因子的表達(dá)，保護受損器官的作用。近年來動物實驗表明，EPO可延緩慢性腎病的進展，改善腎間質(zhì)纖維化的程度，有一定的腎保護作用［13］。有研究［14］發(fā)現(xiàn)，EPO能通過抗氧自由基，提高機體內(nèi)源性抗氧化能力，對急性腎小管壞死大鼠腎臟起到保護作用。研究還發(fā)現(xiàn)EPO可以抑制線粒體膜電位下降、線粒體敏感鉀通道開放及膜間隙促凋亡蛋白釋放等一系列凋亡事件［15］。Nakazawa等［16］研究表明，EPO可抑制腎小管細(xì)胞凋亡，從而減輕腎間質(zhì)纖維化的程度。本研究結(jié)果亦說明EPO可減少腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，以及下調(diào)Drp-1的表達(dá)，腎間質(zhì)纖維化的程度明顯減輕，BUN及SCr水平較對照組有所下降，但上述觀察指標(biāo)EPO組仍與假手術(shù)組有顯著差異，提示EPO對腎間質(zhì)纖維化有一定程度的延緩作用，但似乎不能逆轉(zhuǎn)腎纖維化和腎功能損害的進程。EPO的作用機制可能是通過減少炎癥細(xì)胞浸潤，抑制Drp-1在腎組織的表達(dá)，減輕細(xì)胞凋亡，而發(fā)揮其減少腎間質(zhì)纖維化的作用。

本研究通過建立腎間質(zhì)纖維化大鼠模型，同時予EPO干預(yù)治療，結(jié)果表明了Drp-1的過度表達(dá)可能是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的機制之一，而EPO可能通過抑制UUO大鼠腎組織中Drp-1的表達(dá)，延緩腎間質(zhì)纖維化的進程，對腎臟發(fā)揮保護作用，但EPO通過何種機制抑制UUO大鼠腎組織Drp-1的表達(dá)，尚待進一步研究。

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