張建瑞，管一春，章露文，郝大勇，劉 景，張彩霞，耿愛華，王興玲#

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052 2)鄭州人民醫(yī)院營養(yǎng)科 鄭州 450052

透明帶是包繞在哺乳動(dòng)物卵子和胚胎外圍的糖蛋白基質(zhì)層，由糖蛋白、糖類、透明帶特異蛋白組成。它可在受精過程中作為精子識別受體促進(jìn)精卵結(jié)合并防止發(fā)生多精受精[1]。受精后透明帶自然變硬，隨著胚胎細(xì)胞的分裂以及囊胚的形成，在胚胎內(nèi)部壓力的作用下，透明帶開始變薄直至破裂，隨之囊胚孵出。在體外培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)時(shí)間延長、培養(yǎng)過程中缺少細(xì)胞溶解素，均會(huì)造成胚胎透明帶硬化，胚胎孵出困難[2]。輔助孵化是消減透明帶厚度幫助胚胎從透明帶中孵出的技術(shù)，主要采用機(jī)械、化學(xué)或激光等方法將透明帶打孔或削薄?，F(xiàn)有研究[3]表明,激光輔助孵化法(Laser assisted hatching, LAH)是一種簡便、快速、安全的方法。 作者回顧性分析了LAH對冷凍胚胎移植及新鮮胚胎移植臨床妊娠結(jié)局的影響,旨在探討LAH在輔助生殖技術(shù)中的臨床意義。

1 對象與方法

1.1研究對象收集2010年12月至2012年4月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受輔助生殖技術(shù)治療的患者(645個(gè)周期)。①冷凍胚胎移植：患者年齡<35歲，透明帶厚度<15 μm，行常規(guī)體外受精(in vitro fertilization, IVF)或卵細(xì)胞單精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)，失敗<2次，基礎(chǔ)FSH值<15 IU/mL，新鮮周期取消移植并且為第1次冷凍復(fù)蘇周期；按照是否行LAH分為LAH組與對照組，LAH組152個(gè)周期，對照組32個(gè)周期。②新鮮周期移植：患者為新鮮周期移植，透明帶厚度<15 μm，IVF+ICSI失敗<2次，基礎(chǔ)FSH值<15 IU/mL；根據(jù)年齡是否≥35歲和是否行LAH分組，年齡<35歲行LAH共36個(gè)周期，不行LAH 333個(gè)周期；年齡≥35歲行LAH 70個(gè)周期，不行LAH 22個(gè)周期?；颊呔谥橥夂笮蠰AH。研究獲得該院倫理委員會(huì)的同意。

1.2促排卵方案促排卵方案按照患者自身情況采用短方案、長方案或者超長方案,陰道B超見到2個(gè)主導(dǎo)卵泡直徑≥20 mm或者4個(gè)卵泡直徑≥16 mm時(shí)肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素(5 000 IU/支，中國廣東麗珠醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司)10 000 IU, 36～38 h后在陰道超聲指引下行穿刺取卵術(shù),取卵后根據(jù)適應(yīng)證和精液情況行IVF或ICSI。受精后第1～3天觀察胚胎發(fā)育情況。胚胎評級標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行。年齡<35歲并且第1移植周期的患者移植或冷凍2個(gè)胚胎；年齡≥35歲或≥2個(gè)移植周期，移植或冷凍3個(gè)胚胎。胚胎移植后未妊娠的患者，調(diào)養(yǎng)2個(gè)月后再行冷凍胚胎移植。

1.3胚胎玻璃化冷凍復(fù)蘇玻璃化冷凍試劑采用Medicult公司的Embryo Vitri System。首先將胚胎移入1液中1 min，然后轉(zhuǎn)入2液3～5 min，最后轉(zhuǎn)入3液中30 s，迅速放入冷凍麥管投入液氮，操作均在室溫下進(jìn)行。玻璃化冷凍復(fù)蘇均采用Medicult公司的Embryo Warming System。復(fù)蘇時(shí)迅速將冷凍麥管胚胎端置于1液中1 min(37 ℃)，依次移入2液、3液、4液中各3 min(室溫)，最后將胚胎移入G-2培養(yǎng)液，放于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)6%CO2培養(yǎng)箱中。復(fù)蘇后成活卵裂球數(shù)≥50%的胚胎為胚胎復(fù)蘇存活。

1.4LAH倒置顯微鏡安裝OCTAX激光系統(tǒng)。將含有胚胎的微滴放在倒置顯微鏡視野正中央，選取卵周間隙最大部位或碎片較集中區(qū)域進(jìn)行LAH，連續(xù)將透明帶自外向內(nèi)削薄50%～80%，寬度相當(dāng)于透明帶周長的25%。

1.5胚胎移植胚胎移植及內(nèi)膜準(zhǔn)備按文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。

1.6隨訪移植后隨訪按文獻(xiàn)[6]方法進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。定量資料采用t檢驗(yàn), 定性資料采用χ2檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1LAH對冷凍胚胎移植患者的影響2組患者的年齡、不孕年限、不孕類型、內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、復(fù)蘇率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。LAH組的臨床妊娠率、多胎率、種植率均高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 冷凍胚胎移植LAH組與對照組各指標(biāo)比較

2.2LAH對新鮮胚胎移植患者的影響年齡<35歲的患者中，LAH組與對照組各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。年齡≥35歲的患者中，2組年齡、不孕年限、不孕類型、內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)、多胎率和流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但LAH組的臨床妊娠率和種植率均高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 新鮮胚胎移植LAH組與對照組各指標(biāo)比較

3 討論

輔助生殖技術(shù)的成功受多種因素的影響。在輔助生殖技術(shù)中體外培養(yǎng)環(huán)境、患者的年齡及基礎(chǔ)內(nèi)分泌、胚胎的冷凍復(fù)蘇都可能導(dǎo)致胚胎孵出困難，從而導(dǎo)致不能著床，這也是輔助生殖領(lǐng)域種植率和妊娠率低的重要原因之一[7-8]。近年隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，LAH作為新技術(shù)被應(yīng)用到輔助生殖技術(shù)中，從而達(dá)到削弱透明帶的作用[9]。LAH具有快捷、簡單、易于控制的優(yōu)點(diǎn)，目前已成為許多中心的常規(guī)輔助孵化法。關(guān)于LAH的研究報(bào)道也很多,但是許多研究僅僅著手于輔助孵化的單一指征，并未排除其他影響因素，該研究嘗試剔除影響輔助孵化的其他影響因素，分析LAH對冷凍胚胎移植及新鮮胚胎移植的影響。在冷凍胚胎移植患者中，作者選取患者年齡<35歲、透明帶厚度<15 μm、IVF+ICSI失敗<2次、基礎(chǔ)FSH值<15 IU/mL及新鮮周期取消移植并且為第1次冷凍復(fù)蘇周期的患者，排除了年齡、透明帶厚度、重復(fù)失敗及基礎(chǔ)FSH的影響。研究結(jié)果顯示，在年齡、不孕年限、不孕類型和內(nèi)膜厚度無差異的情況下，LAH并未提高冷凍胚胎患者的臨床妊娠率、多胎率和種植率，與Ng等[10-11]的結(jié)果一致，因此認(rèn)為對冷凍胚胎移植患者不必常規(guī)行LAH。而谷瑞環(huán)等[7，12-13]的結(jié)果顯示LAH有助于提高冷凍胚胎移植患者的妊娠結(jié)局，這種差異可能是研究對象的基本情況、胚胎質(zhì)量的不同造成的。

對于新鮮胚胎移植患者，作者首先將患者按照年齡分為≥35歲組和<35歲組，選取了新鮮周期移植、透明帶厚度<15 μm、IVF+ICSI失敗<2次及基礎(chǔ)FSH值<15 IU/mL的患者，排除了冷凍胚胎、透明帶厚度、重復(fù)失敗及基礎(chǔ)FSH的影響。研究結(jié)果顯示，在年齡、不孕年限、不孕類型、內(nèi)膜厚度及移植胚胎數(shù)無差異的情況下，<35歲的LAH患者的臨床妊娠率、多胎率、流產(chǎn)率和種植率與對照組比較，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Rufas-Sapir等[14]的結(jié)果一致，提示LAH并未提高年輕患者的妊娠率；但≥35歲的LAH患者的臨床妊娠率和種植率均高于對照組，與張琪瑤等[15]的研究結(jié)果一致?？赡茉?yàn)楦啐g患者透明帶的薄化能力減弱，透明帶變硬，使胚胎的孵出困難，導(dǎo)致著床失敗。

綜上所述，LAH并不是對所有患者都有效，僅在一定程度上對高齡新鮮胚胎移植患者有助于提高其妊娠率和種植率。但是激光打孔時(shí),激光熱效應(yīng)不可避免地會(huì)對卵裂球產(chǎn)生一定的影響，另外LAH后的單卵雙胎率升高，提高了患者圍產(chǎn)期、分娩期的危險(xiǎn)[16]，這就要求臨床醫(yī)生在實(shí)際工作中應(yīng)嚴(yán)格掌握LAH的指征，盡量避免不必要的輔助孵化。

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