張艷麗，王秀芳，喬俊英，雷瑞瑞，宋 麗，劉 瑩

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒內(nèi)科 鄭州 450052

哮喘是一種慢性氣道炎癥性疾病，嚴(yán)重危害兒童的身心健康。其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，但細(xì)胞因子在該病中的作用已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來(lái)越多的關(guān)注。近年來(lái)，白細(xì)胞介素-10(interleukin-10, IL-10)和白細(xì)胞介素-12(interleukin-12，IL-12)作為Th細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，在哮喘發(fā)病中的作用越來(lái)越受到重視[1]。另外，國(guó)外對(duì)哮喘動(dòng)物模型的研究[2]表明免疫細(xì)胞與哮喘相關(guān)，但機(jī)制不明。髓系抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells, MDSCs)是起源于骨髓、CD11b+CD33+的抑制性細(xì)胞，在重癥感染、腫瘤、急慢性炎癥等患者中明顯增多，并且負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[3-4]。關(guān)于MDSCs與兒童哮喘之間的關(guān)系國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。該研究通過(guò)檢測(cè)哮喘患兒外周血MDSCs和血清IL-10及IL-12的水平，探討它們?cè)趦和l(fā)病中的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇2011年1月至2012年4月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒內(nèi)科門診就診或住院治療的急性發(fā)作期哮喘患兒52例為哮喘發(fā)作組，其中男28例，女24例，年齡1.9～4.9(3.1±1.1)歲；選擇同期的哮喘緩解期患兒50例為哮喘緩解組，其中男26例，女24例，年齡1.8～4.7(2.9±0.9)歲；診斷均參照《全球哮喘防治創(chuàng)議》中的哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。選擇同期在該院兒童保健部健康體檢兒童48例為正常對(duì)照組, 其中男26例，女22例，年齡2.2～5.0(2.9±0.9)歲；45例同期在該院兒內(nèi)科住院的肺炎患兒為肺炎對(duì)照組，其中男24例，女21例，年齡1.9～4.9(2.8±0.8)歲。均獲得入選患兒家長(zhǎng)書面知情同意，并征得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的同意。

1.2外周血MDSCs的檢測(cè)取抗凝血30 μL，加入上機(jī)管中，避光條件下分別加入CD11b+、CD33+標(biāo)記的抗體各3 μL，振蕩，混勻，管底部插入冰中避光孵育20 min，然后取出，加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，振蕩后避光裂解15 min，離心，棄上清，加入PBS液1 mL，振蕩，混勻，再離心，棄上清，加入PBS液1 mL，振蕩，混勻，再離心，棄上清，加入40 g/L多聚甲醛300 μL，振蕩，混勻，4 ℃冰箱保存，1周內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用兩色熒光標(biāo)記技術(shù)流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定，分析采用CELLQuest軟件，用FSC/SSC設(shè)門，畫出有核細(xì)胞群(R1)，以去除死細(xì)胞及細(xì)胞碎片，二維點(diǎn)圖顯示R1內(nèi)細(xì)胞，右上顯示CD11b+/CD33+二維點(diǎn)圖。結(jié)果以MDSCs占單個(gè)核細(xì)胞的比例表示。

1.3血清IL-10、IL-12的檢測(cè)受試者于就診第1天或入院第1天空腹采集股靜脈血3 mL，立即置于不加任何抗凝劑的干燥試管內(nèi)，于水浴箱37 ℃水浴1 h后，3 000 r/min離心10 min，迅速、小心地分離出血清置于無(wú)菌EP管內(nèi)，放置-70 ℃冰箱保存，以待檢測(cè)血清IL-10、IL-12水平。 IL-10、IL-12的測(cè)定采用雙抗體夾心ELISA法(ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R & D公司)，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書的步驟進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析。各組間MDSCs、IL-10及IL-12水平的比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)；哮喘發(fā)作組MDSCs與IL-10、IL-12的關(guān)系應(yīng)用Pearson積差相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組兒童外周血MDSCs、血清IL-10及IL-12水平比較結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組外周血MDSCs、血清IL-10及IL-12水平比較

*：與其他3組比較，P均<0.05。

2.2哮喘發(fā)作組患兒外周血MDSCs與IL-10、IL-10的相關(guān)性相關(guān)分析結(jié)果顯示，哮喘發(fā)作組患兒外周血MDSCs與IL-10呈正相關(guān)(r=0.741，P=0.007)，與IL-12呈負(fù)相關(guān)(r=-0.879，P=0.014)。

3 討論

TH1/TH2 平衡理論作為過(guò)敏性疾病如支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的核心已為大多數(shù)人所接受。IL-12是最重要的Th1型細(xì)胞因子之一，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，在機(jī)體抗感染免疫及炎癥過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[2]。IL-10主要是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多面性生物活性的強(qiáng)免疫抑制因子，它可以抑制多種細(xì)胞合成相關(guān)細(xì)胞因子，改變機(jī)體的免疫應(yīng)答和MHCⅡ類抗原的表達(dá)。IL-10在哮喘中的作用存在爭(zhēng)議。MDSCs可負(fù)向調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[3]，它可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)間接影響T細(xì)胞的激活，Tregs可以下調(diào)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)?；谏鲜鰴C(jī)制，作者推測(cè)MDSCs在患兒哮喘過(guò)程中也起到重要的作用。

國(guó)外學(xué)者Grissell等[6]研究表明病毒感染誘發(fā)的哮喘，IL-10呈高表達(dá)狀態(tài)。該結(jié)果顯示，哮喘發(fā)作組較其他3組血清IL-10水平顯著升高，與上述報(bào)道相一致。

IL-12在哮喘發(fā)病中起重要作用，并且其基因多態(tài)性與哮喘發(fā)病的危險(xiǎn)指數(shù)相關(guān)[7]。周洋等[8]研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)測(cè)定IL-12水平是判斷支氣管哮喘病情變化的有益指標(biāo)，這與該研究發(fā)現(xiàn)的哮喘發(fā)作組與其他3組相比，血清IL-12水平顯著降低相一致。

Poe等[9]研究表明患細(xì)菌性肺炎的小鼠中MDSCs樣細(xì)胞和肺IL-10水平增加，這與該研究中肺炎對(duì)照組外周血MDSCs水平、血清IL-10水平無(wú)明顯增加相反，推測(cè)可能與該研究對(duì)象為人相關(guān)。Kosaka等[10]研究表明細(xì)胞因子IL-10在MDSCs的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)方面起重要作用；國(guó)外學(xué)者Kao等[11]發(fā)現(xiàn)MDSCs通過(guò)下調(diào)巨噬細(xì)胞分泌的IL-12水平發(fā)揮抑制作用，Bunt等[12]研究顯示劇烈炎癥可誘導(dǎo)MDSC產(chǎn)生高水平的IL-10，其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-12的減少依賴于MDSCs產(chǎn)生較多的IL-10。這與該研究發(fā)現(xiàn)MDSCs與IL-10呈正相關(guān)，與IL-12呈負(fù)相關(guān)相一致。因此推測(cè)MDSCs和巨噬細(xì)胞的相互作用引起IL-10的顯著升高和IL-12的降低促進(jìn)了哮喘慢性炎癥的發(fā)展。MDSCs可能成為哮喘治療的新靶點(diǎn)，至于MDSCs在哮喘發(fā)病過(guò)程中更確切的機(jī)制及治療應(yīng)用尚待進(jìn)一步研究。

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