王彥芳，闞全程#，余祖江，李朵璐，關(guān)克磊

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州 450052

肝臟是氨的主要代謝場所，血氨濃度增高與肝損害有關(guān)，主要表現(xiàn)為對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟有很強(qiáng)的毒性[1]。Bhatia等[2]的研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈血氨濃度>124 μmol/L與重型肝性腦病和腦水腫發(fā)生相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[3]證實(shí)膽紅素可作為機(jī)體的抗氧化物質(zhì)發(fā)揮極強(qiáng)的抗氧化作用。臨床中發(fā)現(xiàn)血氨濃度與膽紅素水平正相關(guān)，但氨致膽紅素代謝紊亂的具體機(jī)制尚不清楚。目前，國內(nèi)外關(guān)于氨引起星形膠質(zhì)細(xì)胞代謝及形態(tài)改變的機(jī)制研究較多[4],但是關(guān)于氨對(duì)肝細(xì)胞的毒性，尤其是對(duì)肝臟中酶活性的影響研究甚少。作者針對(duì)臨床上出現(xiàn)的高血氨合并高膽紅素的現(xiàn)象，構(gòu)建高血氨動(dòng)物模型，觀察氨對(duì)血清總膽紅素(total bilirubin,TBIL)與直接膽紅素(direct bilirubin,DBIL)水平、膽紅素代謝相關(guān)的血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)和尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1(UDP-glucuronosyltransferase 1A1, UGT1A1)的誘導(dǎo)作用及對(duì)核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路的影響，闡明氨對(duì)膽紅素代謝的阻礙作用，以期為臨床降氨藥物的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器25只雄性清潔級(jí)Wistar大鼠購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)SCXK(豫)2005-0001，體質(zhì)量180～230 g。NH4Cl(生工生物工程上海股份有限公司),Trizol Reagent(Invitrogen公司)，RevetAidTMFirst Strand cDNA合成試劑盒、DreamTap Green PCR Master Mix(Fermentas公司)，Rat TBIL ELISA 試劑盒(RD，CK-E91034R)，Rat DBIL ELISA 試劑盒(RD，CK-E91035R)，兔抗-HO-1/HSP32抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bs-0827R)，鼠抗NF-κB P65抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，sc-8008)，山羊血清封閉液(武漢博士德生物工程有限公司，AR0009)。PCR儀(S1000TMThermal Cycler，BIORAD)，DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，熒光顯微鏡，德國蔡司公司；微量分光光度計(jì)NanoDrop 2000，Thermo科技公司，酶標(biāo)儀，MultiskanMK3。

1.2高血氨大鼠模型的建立25只大鼠分為2組。高血氨組15只：每天早上8點(diǎn)和下午4點(diǎn)按100 mL/g給予100 g/L的NH4Cl灌胃；對(duì)照組10只，給予等量生理鹽水；共灌胃4周。實(shí)驗(yàn)中高血氨組死亡3只。

1.3大鼠血清TBIL、DBIL水平測定采用ELISA法。每周心臟采血1次，3 000 r/min離心后取上清，96孔板每孔加上清10 μL、稀釋液40 μL、HRP標(biāo)記的抗體反應(yīng)液50 μL，37 ℃溫箱中孵育1 h。洗滌液洗板5次甩干，每孔加反應(yīng)液A和B各50 μL，37 ℃溫箱中孵育15 min，每孔加終止液100 μL，酶標(biāo)儀上檢測405 nm處的吸光度值，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TBIL或DBIL的水平。

1.4大鼠肝組織HO-1和NF-κB的檢測灌胃4周后心臟灌流摘取其肝臟，取部分用4 g/L的多聚甲醛固定。常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水；pH 6.0檸檬酸修復(fù)抗原；滴加體積分?jǐn)?shù)3%的H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶；山羊血清封閉內(nèi)源性生物素。滴加一抗(兔抗-HO-1抗體按1400稀釋；鼠抗NF-κB P65抗體按1300稀釋)，4 ℃過夜；滴加二抗，50 μL/片，37 ℃ 30 min；滴加辣根酶標(biāo)記卵霉鏈白素； DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照。用Image-Pro Plus 6.0分析，以單位面積內(nèi)陽性物質(zhì)積分光密度值作為HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。NF-κB陽性細(xì)胞百分比的統(tǒng)計(jì)：每組計(jì)數(shù)5張圖片中的100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。

1.5大鼠肝組織UGT1A1mRNA的檢測采用RT-PCR法。采用異硫氰酸胍一步法提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。UGT1A1引物序列：上游5’-CCTCTCTGGAACAAAGCCACT-3’，下游 5’-AAG GCAGTTTATCCCACCAAT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為431 bp； GAPDH引物序列：上游5’-CAGTGCCAGC CTCGTCTCAT-3’，下游5’-AGGGGCCATCCA CAGTCTTC-3’ ,擴(kuò)增產(chǎn)物大小為595 bp，由生工生物工程上海股份有限公司合成。反應(yīng)總體系為25 μL：DreamTap Green PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，加雙蒸水至25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR 產(chǎn)物以20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳。以目的條帶和GAPDH條帶光密度值的比值作為UGT1A1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SAS 9.1處理數(shù)據(jù)。采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析比較2組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TBIL和DBIL水平，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較處理4周后2組大鼠肝臟組織HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量、NF-κB陽性細(xì)胞百分比及UGT1A1 mRNA的表達(dá)水平，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠血清TBIL與DBIL水平比較高血氨組TBIL和DBIL水平明顯高于對(duì)照組，見表1、2。

表1 2組大鼠血清TBIL水平比較 μmol/L

F組間=201.524，F(xiàn)時(shí)間=446.552，F(xiàn)交互=89.223，P均<0.001。

表2 2組大鼠血清DBIL水平比較 μmol/L

F組間=131.864，F(xiàn)時(shí)間=455.413，F(xiàn)交互=57.882，P均<0.001。

2.2 2組大鼠肝組織HO-1和NF-κB的表達(dá)見圖1。HO-1 陽性物質(zhì)呈棕黃色，主要定位于胞質(zhì)。高血氨組HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量為(2 250.31±620.43)，較對(duì)照組的(156.66±10.28)上調(diào)(t=56.829，P<0.001)。NF-κB被激活后轉(zhuǎn)移至胞核，胞核呈棕黃色者為陽性。高血氨組可見核內(nèi)染色加深，陽性細(xì)胞百分比為(0.248±0.052)%，較對(duì)照組的(0.072±0.033)%增加(t=62.347，P<0.001)。

圖1 2組大鼠肝組織HO-1和NF-κB的表達(dá)(SP，×400)

2.3 2組大鼠肝組織UGT1A1mRNA的表達(dá)RT-PCR結(jié)果見圖2。高血氨組UGT1A1 mRNA的表達(dá)水平(0.611±0.152)高于對(duì)照組的(0.328±0.063)(t=6.449，P<0.001)。

圖2 2組肝組織UGT1A1 mRNA的表達(dá)

3 討論

HO-1是影響膽紅素生成的關(guān)鍵酶，同時(shí)也是評(píng)估細(xì)胞氧化損傷的重要參考指標(biāo)[5]。該實(shí)驗(yàn)中高血氨組大鼠肝組織HO-1的表達(dá)增強(qiáng)，預(yù)示著大鼠肝細(xì)胞已處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。另有文獻(xiàn)[6]報(bào)道在星形膠質(zhì)細(xì)胞中NH4+介導(dǎo)的氧化壓力導(dǎo)致HO-1過表達(dá)，而直接的氧化物清除劑?；撬岷屯屎谒乜梢杂行б种芅H4+介導(dǎo)的HO-1過表達(dá)。NF-κB廣泛存在于各種細(xì)胞中，通常與IκB 結(jié)合，使細(xì)胞中NF-κB 處于p50-p65-IκBβ多聚體的無活性狀態(tài)，錨定在細(xì)胞質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞因子、脂多糖、氧自由基等刺激時(shí)，IκB發(fā)生磷酸化并迅速降解，激活的NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，調(diào)控相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。近來研究[7]發(fā)現(xiàn)，NF-κB和MAPK通路可被活性氧激活，HO-1 的啟動(dòng)子區(qū)域含有NF-κB 結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB 激活后可上調(diào)HO-1的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)中高血氨組大鼠肝組織出現(xiàn)NF-κB的核內(nèi)轉(zhuǎn)移增加并伴有HO-1的過表達(dá)，與上述研究相符。文獻(xiàn)[7]也報(bào)道梗阻性黃疸發(fā)生時(shí)，肝臟中的NF-κB 被顯著激活，出現(xiàn)核移位，體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧簇。而在星形膠質(zhì)細(xì)胞中，NF-κB 的快速活化參與了膽紅素所致的神經(jīng)毒性損傷[8]。

膽紅素是血紅素的代謝產(chǎn)物，在肝臟微粒體UGT酶的催化下，間接膽紅素轉(zhuǎn)變?yōu)镈BIL而排泄。其中UGT1A1 和UGT1A5被稱為膽紅素代謝群，尤其以UTG1A1的作用最明顯[9]。生理水平的膽紅素可以保護(hù)細(xì)胞膜抵抗脂質(zhì)過氧化，其氧化能力甚至超過了維生素C和E[10]。已有實(shí)驗(yàn)[3]證明了膽紅素對(duì)抗間二硝基苯所致的氧化應(yīng)激作用，同時(shí)證明HO-1活力的升高在氧化應(yīng)激時(shí)起到了提高膽紅素水平的作用。該實(shí)驗(yàn)中，高血氨組大鼠經(jīng)NH4Cl灌胃4周后，肝組織UGT1A1 mRNA的表達(dá)明顯升高，推測可能是HO-1活力升高后提高UGT1A1底物(膽紅素水平)的結(jié)果。而長期慢性HO-1上調(diào)釋放的鐵離子和CO會(huì)加重細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致膽紅素水平的升高和UGT1A1的持續(xù)性高表達(dá)。諸多研究[9,11-12]也證實(shí)，UGT除了受孕烷X受體、組成型雄甾烷受體等孤兒核受體調(diào)節(jié)外，還與其底物膽紅素有關(guān)。

該研究結(jié)果表明，大鼠經(jīng)NH4Cl灌胃4周后，肝細(xì)胞已處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致了NF-κB的核內(nèi)轉(zhuǎn)移增加，NF-κB 激活后上調(diào)HO-1的表達(dá)。HO-1的過表達(dá)是氨介導(dǎo)的氧化壓力的結(jié)果，而UGT1A1的升高亦可能是HO-1活力升高后提高其底物(膽紅素水平)的結(jié)果。但是有關(guān)HO-1對(duì)膽紅素代謝及其代謝酶調(diào)控的詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

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