程 劍，沈曉潔，劉 艷

無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校病理學(xué)教研室 無錫 214028

白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)是一種抗炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子。研究[1]表明，IL-10可以抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、趨化因子和細(xì)胞間黏附分子mRNA的表達(dá)，從而減輕大鼠的肝損傷。Donckier等[2]發(fā)現(xiàn)對豬的肝臟給予IL-10的預(yù)治療，可以降低受體的轉(zhuǎn)氨酶以及減少肝臟的炎性細(xì)胞浸潤和細(xì)胞壞死，減輕肝臟的損傷。另外，T細(xì)胞在肝損傷中扮演著重要的角色，IL-10在肝損傷時不僅抑制枯否細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，還抑制T細(xì)胞功能[3]。因此，IL-10具有保護(hù)肝細(xì)胞的功能，在肝臟外科和器官移植領(lǐng)域中有很大的應(yīng)用潛力。作者構(gòu)建了攜帶人IL-10(hIL-10)基因的非增殖型重組腺病毒載體，體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，為IL-10基因治療在肝臟外科和肝臟移植領(lǐng)域中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1攜帶hIL-10基因的重組腺病毒載體的構(gòu)建合成hIL-10引物(上游：5’-CCGGAATTCACCATG GCCCACAGCTCAGC-3’，含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；下游：5’-CGACGTCGACTTATCAGTTTCGTATCTTCATTGTC -3’， 含SalⅠ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小552 bp)和EGFP引物(上游：5’-GGAAGATCTACCATGGTGAG CAAGGGC-3’, 含BglⅡ酶切位點(diǎn)；下游：5’-TG CACTCGAGTTATTATCTAGATCCGGTGGATC-3’，含XhoⅠ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小760 bp)。以pORF-hIL-10質(zhì)粒(美國Invivo Gen公司產(chǎn)品)為模板，用hIL-10引物PCR擴(kuò)增hIL-10 cDNA序列。反應(yīng)參數(shù)：96 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s變性，60 ℃ 30 s退火，72 ℃ 60 s延伸，共20個循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用80 g/L瓊脂糖凝膠電泳, 用膠回收試劑盒回收大小為552 bp的DNA片段。將該片段克隆入pUC19載體中，測序鑒定。將pUC19-hIL-10酶切，回收hIL-10 cDNA片段，克隆入pDC315載體，構(gòu)建pDC315-hIL-10。同樣方法構(gòu)建對照腺病毒載體pDC315-EGFP。

將質(zhì)粒pDC315-hIL-10、pDC315-EGFP分別與5型腺病毒骨架質(zhì)粒pBGHE3通過Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)同源重組。2周后各挑取病毒噬斑2個，應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取腺病毒DNA，經(jīng)PCR鑒定重組腺病毒DNA中是否克隆了hIL-10、EGFP基因。鑒定正確后，命名為Ad5-hIL-10和Ad5-EGFP。病毒在293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增，氯化銫梯度離心法純化。

1.2大鼠肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)清潔級的雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心提供。采用二步膠原酶灌注法分離大鼠肝細(xì)胞[4]，懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3腺病毒載體感染效率的測定大鼠肝細(xì)胞鋪96孔板，1×103孔-1，培養(yǎng)24 h，換用無血清培養(yǎng)液，加入感染強(qiáng)度(MOI)=1、5、10、50的Ad5-EGFP，輕搖2 h，吸除上清，換用體積分?jǐn)?shù)2%血清培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，熒光顯微鏡下觀察，在熒光顯微鏡暗視野及明視野交替切換，選擇3個200倍視野，計數(shù)綠色熒光陽性細(xì)胞，并計算陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4Ad5-hIL-10基因表達(dá)的測定大鼠肝細(xì)胞鋪96孔板，5×104孔-1，培養(yǎng)24 h，換用無血清培養(yǎng)液，加入MOI分別為1、5、10、50的Ad5-hIL-10，輕搖2 h，吸除上清，換用體積分?jǐn)?shù)2%血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。收集培養(yǎng)細(xì)胞上清，采用hIL-10 ELISA試劑盒(Invitrogen公司產(chǎn)品)測定hIL-10含量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，方法參考試劑盒說明。

1.5Ad5-hIL-10對CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用大鼠肝細(xì)胞鋪96孔板，5×104孔-1，培養(yǎng)24 h后，分組處理，每組設(shè)8個復(fù)孔。A組為實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞貼壁后，換用無血清培養(yǎng)液，加入MOI分別為1、5、10、50的Ad5-hIL-10，輕搖2 h，吸除上清，換用體積分?jǐn)?shù)2%血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，加入CCl4(北京化工廠產(chǎn)品)至終濃度0.5 mol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。B組為損傷對照組：細(xì)胞感染Ad5-EGFP，與A組同步加入相同濃度的CCl4。C組為空白對照組：細(xì)胞同步培養(yǎng)，不加病毒和CCl4。采用MTT法檢測細(xì)胞存活率。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行分析。不同MOI預(yù)處理大鼠肝細(xì)胞中綠色熒光陽性細(xì)胞比例、hIL-10含量及3組肝細(xì)胞存活率的比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1重組腺病毒的鑒定病毒噬斑經(jīng)PCR均擴(kuò)增出hIL-10或EGFP基因(圖1)。

2.2Ad5-EGFP對大鼠肝細(xì)胞的感染效率隨著MOI的升高，病毒感染效率也逐漸增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.571,P<0.001)。見表1、圖2。

表1 大鼠肝細(xì)胞中

*:與MOI=1相比，P<0.01；#：與MOI=5相比，P<0.01；△：與MOI=10相比，P<0.01。

2.3Ad5-hIL-10基因的表達(dá)大鼠肝細(xì)胞上清中hIL-10含量見表1。隨著MOI的升高，hIL-10含量上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.667，P<0.001)。

圖1 重組腺病毒Ad5-hIL-10(上)和Ad5-EGFP(下)的PCR鑒定結(jié)果

圖2 腺病毒Ad5-EGFP感染大鼠肝細(xì)胞的效率(×200)

2.4hIL-10表達(dá)對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用見表2。

表2 各組大鼠肝細(xì)胞存活率的比較

*:與B組比較，P<0.05；#:與C組比較，P<0.05。

3 討論

肝炎、肝炎后肝硬化以及肝臟外科手術(shù)、肝移植都存在肝細(xì)胞的損傷，如何減輕肝細(xì)胞損傷、保護(hù)肝功能成為肝臟病治療中需要面對的問題。通過基因治療手段來預(yù)防和減輕肝損傷是近年來人們研究的一個新方向。

IL-10是一種多效應(yīng)的細(xì)胞因子，它的主要功能就是限制和終止炎癥反應(yīng)[5]。IL-10由Th2分泌, 能抑制Th1型細(xì)胞因子的分泌，對細(xì)胞免疫和體液免疫及炎癥過程均有廣泛影響[6-7]。hIL-10與鼠IL-10蛋白有73%的同源性，hIL-10蛋白可作用于鼠細(xì)胞，而鼠IL-10蛋白對人細(xì)胞并不起作用。hIL-10 主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞分泌，Th1和Th2受刺激后均可分泌，肝內(nèi)枯否細(xì)胞也可分泌。近年來的研究證實(shí)，IL-10是一個多效性細(xì)胞因子, 具有廣泛的生物學(xué)作用：可以抑制T 淋巴細(xì)胞，主要參與T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)，抑制T 淋巴細(xì)胞激活，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞免疫耐受，抑制抗體依賴性T 淋巴細(xì)胞的增殖[8]；刺激B 淋巴細(xì)胞，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞激活及其抗體分泌[9]；抑制單核巨噬細(xì)胞的激活及其細(xì)胞因子的分泌[10]；抑制前炎性細(xì)胞因子分泌?？傊?，IL-10 是一種生物學(xué)作用廣泛的細(xì)胞因子，IL-10 的肝細(xì)胞保護(hù)作用是一個重要方面。IL-10 可通過抑制前炎性細(xì)胞因子的分泌、抑制中性粒細(xì)胞的激活與其黏附分子的表達(dá)等機(jī)制，來抑制肝損傷時的急性期增殖反應(yīng)和肝纖維化的發(fā)生。

作者以腺病毒為載體成功構(gòu)建了攜帶hIL-10基因的Ad5-hIL-10，該腺病毒載體可以高效率體外感染大鼠肝細(xì)胞并表達(dá)其攜帶的外源基因hIL-10，為外源基因行使生物功能奠定了良好的基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，作者建立CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷模型，采用Ad5-hIL-10進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)，發(fā)現(xiàn)可以有效預(yù)防肝細(xì)胞損傷，提高肝細(xì)胞在損傷誘導(dǎo)劑存在情況下的存活率。該攜帶hIL-10基因的腺病毒載體在肝病領(lǐng)域中將有很大的應(yīng)用潛力。

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